Sporing Drosophila larver atferd som svar til Optogenetic stimulering av Olfactory nerveceller
Summary
Denne protokollen analyserer navigasjons virkemåten til Drosophila Larven svar på samtidige optogenetic stimulering av dets olfactory neurons. Lys 630 nm wavelength brukes til å aktivere individuelle olfactory neurons uttrykke en rød-skiftet kanal rhodopsin. Larver bevegelse registreres samtidig, registrert digitalt og analysert ved hjelp av tilpasset skrevet programvare.
Abstract
Muligheten for insekter å navigere mot lukt er basert på aktivitetene deres første orden olfactory reseptor neurons (ORNs). Mens har generert en betydelig mengde informasjon om ORN Svar å odorants, fortsatt rollen til bestemte ORNs i kjøring atferdsdata svar dårlig forstått. Komplikasjoner i atferd analyser forekomme forskjellige volatilities av odorants som aktiverer personlige ORNs, flere ORNs aktivert av én odorants, og vanskeligheter med replikere naturlig observert timelige variasjoner i olfactory stimuli bruker konvensjonelle lukt levering metoder i laboratorier. Her beskriver vi en protokoll som analyserer Drosophila larver atferd svar på samtidige optogenetic stimulering av sin ORNs. Optogenetic teknologi brukes her gir spesifisitet av ORN aktivisering og presis kontroll over timelige bruksmønstre ORN aktivisering. Tilsvarende larver bevegelse registreres, registrert digitalt og analysert ved hjelp av tilpasset skrevet programvare. Ved å erstatte lukt stimuli med lys stimuli, gir denne metoden en mer nøyaktig kontroll over personlige ORN aktivisering for å studere virkningen på larver atferd. Vår metode kan utvides ytterligere for å studere virkningen av andre-ordens projeksjon neurons (PNs) samt lokale neurons (LNs) larver oppførsel. Denne metoden vil dermed gjøre en omfattende Disseksjon av olfactory krets funksjon og supplement studier på hvordan olfactory Nevron aktiviteter oversette i atferd svar.
Introduction
Olfactory informasjon i en Drosophila Larvenes miljø er kjente av bare 21 funksjonelt forskjellige ORNs, aktiviteter som til slutt bestemmer larver atferd1,2,3,4. Likevel, relativt lite er kjent om logikken som sensoriske informasjonen kodes i aktivitetene til disse 21 ORNs. Det er derfor behov eksperimentelt måle funksjonelle bidrag av hver larver ORN virkemåten.
Selv om sensoriske reaksjon profilen til hele repertoaret av Drosophila larver ORNs har vært studert i detalj1,4,5, bidrag av individuelle ORNs olfactory krets og dermed navigasjons problemet forblir hovedsakelig ukjent. Vanskeligheter i larver atferd studier, så langt, forekomme kan romlig og timelig aktivere enkelt ORNs. Et panel av odorants spesielt aktivere 19 av de 21 Drosophila larver ORNs var nylig beskrevet1. Hver odorant i panelet i lave konsentrasjoner utløser en fysiologiske reaksjon fra sin beslektet ORN. Men i høyere konsentrasjoner som vanligvis brukes for konvensjonelle atferd analyser utløser hver odorant fysiologiske responser fra flere ORNs1,5,6. Videre har odorants i dette panelet variert volatilities som komplisere tolkning av atferd studier som dannelsen av stabil lukt graderinger7,8. Endelig naturlig har forekommende lukt stimuli en verdslig komponent som er vanskelig å gjenskape under laboratorieforhold. Det er derfor viktig å utvikle en metode som kan måle larver oppførsel mens samtidig aktivere personlige ORNs i en romlig og tidsmessige måte.
Her viser vi en metode som har fordeler over beskrevet tidligere larver sporing søk1,8. Sporing analysen beskrevet i Gershow et al. bruker elektronisk styrte ventiler for å opprettholde en stabil gradient lukt i atferd arena8. Men på grunn av den komplekse ingeniører som er involvert bygge lukt stimulans oppsettet, er denne metoden vanskelig å gjenskape i andre laboratorier. Videre forblir knyttet til benytter odorants å aktivere spesielt enkelt ORNs uløst. Sporing analysen beskrevet i Mathew et al. bruker en enklere lukt leveringssystem, men resulterende lukt graderingen er avhengig av volatilitet i test odorant og er ustabil for lang varighet av analysen1. Dermed ved å erstatte lukt stimuli med lys stimuli, vår metode har fordeler av spesifisitet og presis timelige kontroll av ORN aktivisering og er ikke avhengig av dannelse av lukt graderinger av forskjellige styrker.
Vår metode er enkel å konfigurere og passer for forskere interessert i å måle aspekter av Drosophila larver navigasjon. Denne teknikken kan tilpasses andre modellsystemer forutsatt at hun kunne kjøre uttrykk for CsChrimson i deres favoritt systemets neuron(s) valgfrihet. CsChrimson er en rød-skiftet versjon av kanalen rhodopsin. Det aktiveres på bølgelengder som er usynlig av Larvenes phototaxis systemet. Vi er derfor kunne manipulere aktiviteten av neurons med spesifisitet, pålitelighet og reproduserbarhet9. Ved å endre egendefinert skrevet programvare til endres av fag, kan denne metoden lett bli tilpasset for kravlesøk larver av andre insekt arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi en metode som tillater for måling av Drosophila larver atferd svar på samtidige optogenetic aktivisering av olfactory neurons. Tidligere beskrevet larver sporing metoder1,8 bruke forskjellige lukt levering teknologi til å aktivere ORNs. Men kan ikke disse metodene kontrollere for enten spesifisitet eller temporal bruksmønstre ORN aktivisering. Vår metode overvinner disse underskudd med lys stimuli i stedet for lukt stimuli for mer nø…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet ved oppstart midler fra University of Nevada, Reno og NIGMS av National Institute of Health under bevilgning nummer P20 GM103650.
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
- Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
- Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
- Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
- Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
- Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
- Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
- Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
- Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
- Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
- Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).
