קולגן רקומביננטי אני Microcarriers פפטיד עבור הרחבת התא והשתמש פוטנציאלי שלהם כמערכת מסירה תאים במגיב ביולוגי מדגמן
Summary
אנו מציעים הרחבה תא פרוטוקול על macroporous microcarriers ואת השימוש בהם כמערכת משלוח ב זלוף מגיב ביולוגי כדי להפיץ מטריצה רקמות decellularized. אנו גם כוללים טכניקות שונות כדי לקבוע התפשטות תאים ואת הכדאיות של תאים תרבותי על microcarriers. יתר על כן, נדגים את הפונקציונליות של התאים לאחר ביוריאקטור תרבויות.
Abstract
הנדסת רקמות הינו תחום מבטיח, התמקדו בפיתוח פתרונות עבור הביקוש הגובר על רקמות ואיברים בנוגע למטרות השתלת. התהליך ליצירת רקמות אלה הינו מורכב, וכולל שילוב של סוגי תאים ספציפיים, פיגומים לגירויים פיזיים או ביוכימי כדי להנחות צמיחת תאים ובידול. Microcarriers מייצגים כלי מושך כדי להרחיב את התאים microenvironment תלת מימד (3D), מאז הם לספק גבוה משטח-יחסי נפח ומחקים באופן הדוק יותר המצב ויוו לעומת שיטות מסורתיות דו-ממדית. מערכת כלי הדם, הספקת חמצן וחומרים מזינים לתאי ולהבטיח פינוי פסולת, מהווה את אבן בניין חשובה בעת יצירת רקמות מהונדסים. למעשה, רוב המבנים להיכשל לאחר להיות מושתל עקב חסר תמיכה בכלי הדם. במחקר זה, אנו מציגים את פרוטוקול להרחבת תא אנדותל על microcarriers מבוססי קולגן רקומביננטי בתנאים דינמיים טווה את הבקבוק, ריאקטורים, נסביר כיצד לקבוע את הגדרת תא הכדאיות ופונקציונליות. בנוסף, אנו מציעים שיטה למסירה תא למטרות vascularization ללא ניתוק נוספים השלבים הנחוצים. יתר על כן, אנו מספקים אסטרטגיה כדי להעריך vascularization תא פוטנציאליים ב זלוף מגיב ביולוגי על מטריצה ביולוגי decellularized. אנו מאמינים כי השימוש בשיטות שהוצגו יכול להוביל לפיתוח טיפולים חדשים מבוססי תאים עבור מגוון גדול של רקמות יישומי בתרגול קליני הנדסה.
Introduction
בעיה כללית אחת ביישומים הנדסת רקמות היא להניב מסה גבוהה תא עם פנוטיפ בידול הנכון במיקום של צריכה. היישום של microcarriers כדי לטפל בבעיה זו החלה בשנת 1967 עם הגדלת חשיבות לתאריך בתחומים כגון: הנדסת רקמות אורתופדי לייצור בקנה מידה גדול של עור, עצם, סחוס, גידים1. הם מאפשרים את הטיפול של תרבויות חסיד בדרכים דומה לזה של הבולם תרבויות2 על ידי הרחבת לתאים microscale תלת מימד (3D) סובסטרטים. ובכך התאים חווים היצע מזין הומוגנית ואינטראקציות תא מטריצה להוביל תחזוקה טובה יותר של ויוו3,בידול4 אשר לעיתים קרובות שאבדו עם הזמן בדו מימד מתקרב5. יחס גבוה יותר של השטח לבנפח – המוביל בסופו של דבר גבוה יותר תא התשואות6,7, גבוה יותר גז ושערי חליפין מזין השוואת מערכות סטטיות8, האפשרות לווסת ולהוריד נושא התרבות הפיזית גירויים9, ואת הפוטנציאל אולם שינוי קנה המידה של תהליך הרחבת7 הם עוד יתרונות. מספר תכונות כגון קוטר, צפיפות, נקבוביות, תשלום משטח הדבקה מאפיינים10,11 להבחין את שונים זמינים מסחרית מיקרו, מאקרו-מנושאות המטוסים שלו. עם זאת, אחד היתרון העיקרי הוא משלוח שלהם פוטנציאל microtissues האתר פגם או דרישה.
עבור יישומים של טכנולוגיית microcarrier בהנדסת רקמות העצם, אנחנו מאויר הדוח הקודם12 הייצור של microcarrier החדש סוג היוו של קולגן רקומביננטי אני פפטיד (RCP, זמינים מסחרית כמו Cellnest). Microcarrier חדש זה מאפשר את GMP התואם את קנה המידה של ההפקה בפיגומים ותא, כנדרש לצורך מסירה תאים תרחיש קליני. בהקשר זה, כוונון של יציבות לגרדום, השפלה קצב ומאפיינים השטח באמצעות בחירה נכונה של אסטרטגיה מתאימה crosslinking מאפשר להתאים את הטכניקה כדי היישום שנבחר, תא סוג של ריבית או היעד רקמת13. בפרט, פוטנציאל להעסקת הזה microcarrier כמערכת משלוח תא להזרקה עבור יישום טיפולי14 גורם להם מעניין במיוחד בסביבה קלינית.
בנייר זה, אנחנו ולכן להמחיש את ההליך culturing הבידוד והרחבה של מח עצם, נגזר mesenchymal סטרומה תאים אנושיים (hBMSCs) ואת עורי microvascular אנדותל תאים אנושיים (HDMECs) על קולגן-אני מבוססי רקומביננטי microcarriers מבוססת על פפטיד, והכנתן למסירה בסביבה קלינית. יתר על כן, אנו מתארים פרוטוקולים נוספים שימושי לשם קיום התא הכדאיות על ההשתלה.
תא הכדאיות לאחר ההשתלה הוא למעשה תלויה בחום vascularization15,16,17, אשר מבטיחה חילופי חמצן וחומרים מזינים ואסטמה ומקילה על פינוי פסולת. אינקובטורים-מטלטל סיבובי מהווים גישה אחת להתגבר על אתגרים vascularization בהנדסת רקמות ולשמור על יכולת הקיום של התא, דרך זלוף בינוני תרבות ובכך מתן חמצן וחומרים מזינים18. כאן, אנו ממחישים שיטה במבחנה כדי להעריך את יכולת העברה של תאים אנדותל microvascular microcarriers RCP biomatrix ואת יכולתם לתרום vascularization דה נובו ואת אנגיוגנזה. Biomatrix הזה הוא קטע מעי צם חזירי decellularized הנקרא BioVaSc (ביולוגי Vascularized לגרדום), עשיר קולגן ואלסטין, עם לשימור מבנים כלי דם, אשר כולל עורק האכלה, המנקזים את הווריד19 כי כבר להחיל עבור בעיות השרשה20.
Protocol
Representative Results
Discussion
אחת המטרה העיקרית של microcarrier היא ההרחבה של תאים תוך שמירה על בידול שלהם על מנת להעביר תאים במקום הצורך. השיטה מייצגים מציגים RCP microcarriers שבו התאים היו מסוגלים לצרף להתרבות, ליישב את microcarriers עם צפיפות גבוהה התא. זה נצפתה על ידי חי/מת מכתים, שבו התגלו יותר מ 90% מכלל התאים קיימא ואילו רק כמה תאים מת?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מן האיחוד האירופי השביעי מסגרת תכנית האיחוד FP7/2007-2013 תחת גרנט הסכם n ° 607051 (ביו-השראה). אנו מודים וקרולין מדריכים סיורים במתחם ואן Spreuwel-גוסנס של Fujifilm ייצור Europe B.V., לקבלת סיוע טכני במהלך הייצור RCP, ורנר סטרקה ממוסד פראונהופר עבור סיליקט מחקר ISC, לקבלת סיוע בניתוח SEM.
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
References
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
- Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
- Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O’Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
- Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
- Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
- Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
- Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
- Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
- Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
- Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
- Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
- Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
- Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
- Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , (2002).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
- Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
- Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
- Plunkett, N., O’Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
- Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).
