تصنيع صفيف متعدد المكروية الخلوية اصطناعية
Summary
توضح هذه المقالة منهجية مفصلة لإعداد مجموعة متعدد المكروية خلوية اصطناعية (ماكمي) عن التلاعب الفائق الفيزيائية والكيميائية العظة محاكاة في فيفو ميكرونفيرونمينتس الخلوية وإلى تحديد البيئة المثلى الخلوية للخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) مع خلية واحدة التنميط.
Abstract
ميكرونفيرونمينتس الخلوية تتكون من مجموعة متنوعة من الرموز، مثل عوامل النمو ومصفوفات خارج الخلية والتفاعلات بين الخلايا. هذه الرموز هي مدبرة جيدا وذات أهمية حاسمة في تنظيم وظائف الخلية في نظام معيشة. على الرغم من أن عددا من الباحثين حاولوا التحقيق في العلاقة بين العوامل البيئية والوظائف الخلوية المرجوة، ما زال غير معروف. هذا إلى حد كبير بسبب عدم وجود منهجية سليمة لتقليد هذه الرموز البيئية في المختبر، وفي نفس الوقت اختبار منبهات بيئية مختلفة في الخلايا. هنا، نحن تقرير منصة متكاملة من القنوات موائع جزيئية ومجموعة نانوفيبير، يليها تحليل خلية واحدة عالية-المحتوى، لبحث تعمل الخلايا الجذعية التي غيرت بعوامل بيئية متميزة. وللتدليل على تطبيق هذا النظام الأساسي، تركز هذه الدراسة على تعمل ذاتيا تجديد الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس). نقدم هنا، إجراءات إعداد مصفوفة نانوفيبير وهيكل موائع جزيئية في تلفيق صفيف متعدد المكروية الخلوية الاصطناعية (ماكمي). وعلاوة على ذلك، يتم وصف الخطوات الإجمالية من خلية واحدة التنميط، خلية تلطيخ مع عدة علامات مضيئة ومتعددة الأسفار التصوير، والتحليلات الإحصائية،.
Introduction
البشرية pluripotent الخلايا الجذعية (هبسكس)1،2 الذاتي تجديد غير محدود، وتفرق في مختلف الأنسجة الأنساب، التي يمكن أن تحدث ثورة في تطوير الأدوية والعلاجات المستندة إلى الخلية، وهندسة الأنسجة والطب التجديدي 3 , 4 , 5 , 6-أطباق الثقافة العامة ولوحات ميكروتيتير، ومع ذلك، ليست مصممة لتمكين التلاعب الخلية الجسدية والكيميائية الدقيقة على المستوى الخلوي مع طائفة من نانو إلى الصغرى-متر، وعامل حاسم لتوسيع الخلوية، التجديد الذاتي، والتمايز. ولمعالجة هذا العيب، حققت الدراسات أدوار ميكرونفيرونمينتس الخلوية في تنظيم قرارات مصير الخلية و وظائف الخلية4. في السنوات الأخيرة، أجريت عددا متزايداً من الدراسات لإعادة بناء ميكرونفيرونمينتس الخلوية في المختبر7،8. وقد أنشأت عمليات تصنيع نانو والصغرى هذه ميكرونفيرونمينتس من خلال التلاعب بالمواد الكيميائية9،10،11،،من1213، 14،15،،من1617 و المادية18،،من1920 العظة البيئية. وحتى الآن، لم ترد تقارير التحقيق بصورة منهجية الآليات الكامنة لمنبهات البيئية الكيميائية والفيزيائية في الخلية-مصير القرارات والمهام داخل منصة واحدة.
وهنا، نقدم استراتيجية تقوم على أساس مبادئ تصميم بسيط إنشاء منصة فحص قوية (الشكل 1). أولاً، يمكننا وصف الإجراء تطوير منهاج عمل موحد لإنشاء ميكرونفيرونمينتس الخلوية تنوعاً، الاصطناعية باستخدام مصفوفة نانوفيبير وبنية موائع جزيئية: صفيف متعدد اصطناعية الخلوية المكروية (ماكمي) (الشكل 1ألف و 2 ألف). يحتوي الصفيف نانوفيبير 12 ميكرونفيرونمينتس مختلفة في تركيبات مختلفة من المواد نانوفيبير والكثافة. واستخدمت اليكتروسبينينج لاختلاق النانو. المواد نانوفيبير، مثل البوليستيرين (PS)21، بوليميثيلجلوتاريميدي (بمجي)22و23من الجيلاتين (GT)، صممت لاختبار خواصها الكيميائية، التي قد تؤثر على التصاق الخلايا والحفاظ على بلوريبوتينسي ( الشكل 2ب). كانت تتفاوت كثافة نانوفيبير بتغيير الوقت اليكتروسبينينج وتم تعريف النانو التي تم إنشاؤها وفقا لهذه الكثافة (الفلبينية، مع د = إكسلوو/منخفض/منتصف/عالي). يتكون هيكل موائع جزيئية من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) إيواء 48 خلية ثقافة الدوائر، والذي يمكن وضعه على طول قياسي أبعاد ميكروسكوبية 96-جيدا. PDMS بوليمر متوافق حيويا وتبديل الغاز تستخدم عموما لاختلاق أجهزة موائع جزيئية24. كل قناة موائع جزيئية قد صمم ليكون 700 مكم واسعة و 8.4 ملم بوقت طويل وكان مداخل اثنين في الحواف (الجدول 1). الدوائر بارتفاعات مختلفة (250، 500، و 1000 ميكرومتر) للتلاعب الأولية البذر خلية الكثافة (0.3 و 0.6 1.2 × 105 خلايا/سم2)، التي قد ترتبط بالبقاء على قيد الحياة، والانتشار، والتفريق بين هبسكس25 (الشكل 2–ج). عدد الخلايا في المصنف إلى غرفة تتناسب مع كثافة العمود فوق أرضية الغرفة، وهكذا الخلية الأولى بذر الكثافة كان يسيطر عليها إدخال تعليق الخلية نفسها في دوائر الثقافة مع ارتفاعات مختلفة. جميع قنوات مصممة لتكون ≥ 250 ميكرون عالية26 التقليل من آثار التوتر المنخفض الأكسجين27 وإجهاد القص28 في الخلايا. يتم اختصار قناة آفاق من 250 و 500 و 1000 ميكرومتر هنا ك XCD مع X = منخفض، منتصف، وعالية، على التوالي. تم تقصير في البيئات مع كثافة نانوفيبير متميزة وكثافة البذر الخلية الأولى ك “الكثافة density_Cell Material_NF” (مثلاً، GT_HighNF_HighCD: بيئة تتسم بالكثافة GT النانو وخلية أولية عالية-البذر الكثافة).
وفي وقت لاحق، نحن تصف كيفية إجراء تحليلات خلية واحدة التحقيق بصورة منتظمة في سلوك الخلية استجابة للعوامل البيئية (الشكل 1ب). كإثبات لمفهوم، حددنا البيئة الخلوية الأمثل لتجديد هبسك المتمتعة بالحكم الذاتي، ومهمة رئيسية ل صيانة (الشكل 1ب) هبسك29. الخلوي المستندة إلى الصور، متبوعاً بالتحليلات الإحصائية، يسمح للتفسير الكمي الفردية الاستجابات المظهرية الخلوية للبيئات الخلوية. من بين مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية، تقدم هذه الورقة إجراء مفصل تحديد الشروط المثلى للحفاظ على هبسك الذاتي تجديد.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يوضح طريقة الفحص الأولى ﻹنشاء نظام ثقافة قوية للصيانة هبسكس المؤهلين. أولاً، يمكننا وصف كيفية إعداد برنامج يضم ECMs الاصطناعية المتنوعة وخلية البذر الكثافة باستخدام جهاز موائع جزيئية متكاملة مع مجموعة نانوفيبير، الصفيف ماكمي. الكمية، والثاني يستند إلى صورة وحيدة الخلية phen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الأستاذ أ. ناكاتسوجي في إيسيمس، جامعة كيوتو، لتوفير حقوق دإط الخلايا. ونشكر أيضا ماروياما ألف الأستاذ في “معهد طوكيو للتكنولوجيا” لدعمه في استخدام مجهر القوة الذرية. سخاء قدم التمويل من “الجمعية اليابانية” “تعزيز العلوم” (JSPS؛ 22350104، 23681028، 25886006، و 24656502)؛ كما تم توفير التمويل “الطاقة الجديدة” ومنظمة تطوير التكنولوجيا الصناعية (نيدو) و “مؤسسة علوم الحياة تيرومو”. WPI-إيسيمس معتمد من قبل في العالم رئيس الوزراء الدولي أبحاث المركز مبادرة (WPI)، ووزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون)، اليابان. جزء من هذا العمل يدعمه مركز تكنولوجيا النانو جامعة كيوتو ومرفق تجهيز نانو داريجا في “مشروع منصة تقنية النانو” تحت رعاية يأمرون، اليابان.
Materials
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
