ייצור של מערך מרובבת MicroEnvironment הסלולר מלאכותי
Summary
מאמר זה מתאר את המתודולוגיה מפורט כדי להכין מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) עבור תפוקה גבוהה מניפולציה גופנית, כימית רמזים היה שווה ויוו הסלולר microenvironments וכדי זיהוי הסביבה התאית אופטימלית עבור תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) עם פרופיל תא בודד.
Abstract
Microenvironments הסלולר להכיל מגוון של רמזים, כגון גורמי גדילה, מטריצה חוץ-תאית, אינטראקציות המערכת. רמזים אלה הם מתוזמר היטב, חיוניות בוויסות תא פונקציות במערכת חיה. למרות מספר חוקרים ניסו לחקור את הקשר בין גורמים סביבתיים לבין הרצוי תאיים, הרבה נותר עלום. זאת במידה רבה בשל חוסר במתודולוגיה נכונה לחקות כזה רמזים סביבתיים במבחנה, ולבדוק במקביל רמזים סביבתיים שונים על תאי. כאן, אנו מדווחים על פלטפורמה משולבת של ערוצי microfluidic, מערך nanofiber, ואחריו ניתוח מתא בודד גבוה-תוכן, לבחון את תאי הגזע פנוטיפים ששונו על ידי גורמים סביבתיים ברורים. כדי להדגים את היישום של הפלטפורמה, מחקר זה מתמקד הפנוטיפים של עצמי חידוש תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs). כאן, אנו מציגים את הליכי הכנת מערך nanofiber ומבנה microfluidic הזיוף של מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME). יתר על כן, מתוארים השלבים הכוללת של פרופילים, תא מכתים עם מספר סמני פלורסנט, הדמיה פלורסצנטיות מרובות ניתוחים סטטיסטיים, תא בודד.
Introduction
Pluripotent האנושי תאי גזע (hPSCs)1,2 עצמית לחדש unlimitedly ו להתמיין שושלות רקמות שונות, אשר יכול לחולל מהפכה פיתוח תרופות, טיפולים מבוססי תאים, הנדסת רקמות, רפואה רגנרטיבית 3 , 4 , 5 , 6. מאכלים תרבות כללית, לוחות microtiter, עם זאת, לא נועדו לאפשר מניפולציה תא הפיסיקליות והכימיות מדויק ברמה התאית עם מגוון של ננו – כדי מיקרו-מטר, הוא גורם קריטי עבור הרחבת הסלולר, התחדשות עצמית, בידול. כדי לטפל חיסרון זה, מחקרים חקרו את התפקידים של microenvironments הסלולר בוויסות-גורל החלטות ותא פונקציות4. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מחקרים נערכו לשחזר microenvironments הסלולר במבחנה7,8. תהליכי ייצור ננו מיקרו הקמנו אלה microenvironments באמצעות המניפולציה של כימי9,10,11,12,13, 14,15,16,17 ו הפיזי18,19,20 רמזים סביבתיים. עד עכשיו, היו דיווחים לחקור באופן שיטתי את המנגנון הבסיסי של רמזים סביבתיים הכימי והפיזי על החלטות גורל והפונקציות פלטפורמה אחת.
כאן, אנחנו מציגים אסטרטגיה המבוססת על עקרונות עיצוב פשוט להקים פלטפורמה הקרנה חזקה (איור 1). ראשית, אנו מתארים את ההליך בפיתוח של פלטפורמה משולבת ליצירת microenvironments הסלולר רב-תכליתי, מלאכותי באמצעות מערך nanofiber ומבנה microfluidic: מערך מרובב מלאכותי תאית MicroEnvironment (MACME) (איור 1א’ ו- 2A). המערך nanofiber יש 12 microenvironments שונות שילובים שונים של חומרים nanofiber וצפיפות. Electrospinning שימשה לפברק nanofibers. החומרים nanofiber, כגון פוליסטירן (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22לטין (GT)23, נועדו לבחון את התכונות הכימיות שלהם, דבר שעשוי להשפיע על התא אדהזיה ותחזוקה של pluripotency ( איור 2B). צפיפות Nanofiber היו מגוונות על-ידי שינוי זמן electrospinning, nanofibers שנוצר הוגדרו לפי צפיפות שלהם (החמורה, עם D = XLow/נמוך/בינוני/גבוה). המבנה microfluidic מורכב polydimethylsiloxane (PDMS) מחסה-48 לשכות תרבית תאים, אשר יכולים להיות ממוקם לאורך הממדים סטנדרטי של microplate 96-ובכן. PDMS הוא פולימר מסתיימים, גז-להחלפה משמש בדרך כלל כדי לפברק התקנים microfluidic24. כל ערוץ microfluidic תוכננה להיות 700-מיקרומטר רחב ו- 8.4 מ מ ארוך והיו שני פתחי הכניסה-הקצוות שלה (טבלה 1). התאים היו בגבהים שונים (250, 500, 1000 מיקרומטר) לטיפול הראשוני זורעות תא הצפיפויות 0.3, 0.6 ו 1.2 × 105 תאים/cm, (2) אשר עשוי לתאם עם הישרדות, התפשטות, הבידול של hPSCs25 (איור 2C). מספר התאים נזרע לתא ביחס לצפיפות העמודה מעל הרצפה קאמרית, ובכך התא הראשוני זריעה צפיפות נשלטה על ידי החדרת התליה תא אותו לתוך התרבות תאי בגבהים שונים. כל הערוצים נועדו להיות ≥ 250-מיקרומטר-גבוהה26 כדי למזער את ההשפעות של חמצן נמוך מתח27 ו גזירה28 על התאים. ערוץ לגבהים של 250, 500 ו- 1000 מיקרומטר הם מקוצר כאן כמו XCD עם X = נמוך, בינוני, ו גבוה, בהתאמה. הסביבות עם צפיפויות שונות nanofiber וצפיפות זורעות תא הראשונית קוצרו כמו “צפיפות density_Cell Material_NF” (למשל, GT_HighNF_HighCD: סביבה מאופיין בצפיפות גבוהה nanofibers GT ו גבוהה הראשונית תא זורעות צפיפות).
כתוצאה מכך, אנו נתאר כיצד לבצע ניתוח מתא בודד לחקור באופן שיטתי בהתנהגות התא בתגובה גורמים סביבתיים (איור 1B). כמושג הוכחה-של-, זיהינו את הסביבה התאית אופטימלית עבור hPSC העצמי-חידוש, אשר היא פונקציה מפתח עבור hPSC תחזוקה (איור 1B)29. Cytometry מבוססת תמונה, ואחריו ניתוחים סטטיסטיים, מאפשר פרשנות כמותית של תגובות פנוטיפי הסלולר הפרט סביבות הסלולר. בין מגוון רחב של פונקציות הסלולר, מאמר זה מספק הליך מפורט כדי לזהות את התנאים אופטימאליים לשמירה על התחדשות עצמית hPSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מדגים את השיטה ההקרנה הראשונה להקים מערכת תרבות חזקים לשמירה של hPSCs מוסמך. ראשית, אנחנו תיאר כיצד להכין פלטפורמה שמציעות מגוונות ECMs מלאכותיים ותא זריעה צפיפויות באמצעות מכשיר microfluidic משולב עם מערך nanofiber, המערך MACME. שנית, כמותי המבוסס על תמונות תא בודד phenotyping היה שבוצעו50<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים פרופסור ש Nakatsuji-iCeMS, אוניברסיטת קיוטו, על מתן ES תאים אנושיים. אנו מודים גם פרופסור א מרוימה טוקיו במכון הטכנולוגי התמיכה שלו בשימוש של מיקרוסקופ כוח אטומי. מימון בנדיבות סופק על ידי החברה יפן הקידום של המדע (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006, 24656502); מימון נמסר גם האנרגיה החדשה, ארגון פיתוח טכנולוגיה תעשייתית (NEDO) ושל קרן מדעי החיים Terumo. WPI-iCeMS נתמך על ידי את העולם Premier הבינלאומי מחקר במרכז היוזמה (WPI), משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT), יפן. חלק של עבודה זו נתמכה על ידי רכזת ננוטכנולוגיה באוניברסיטת קיוטו, במתקן ננו-עיבוד AIST “ננוטכנולוגיה פלטפורמה פרויקט” בחסות MEXT, יפן.
Materials
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
