멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작
Summary
이 문서에서는 물리와 화학의 높은 처리량 조작 신호 세포 microenvironments vivo에서 흉내 낸 고을 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 준비 하 상세한 방법론 단일 셀 프로 파일링 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 위한 최적의 휴대폰 환경을 식별 합니다.
Abstract
단서, 성장 인자, 세포 외 매트릭스, 세포 상호 작용 등의 다양 한 세포 microenvironments에 의하여 이루어져 있다. 이러한 신호 잘 조율 된 그리고 생활 시스템에서 세포 기능 조절에 중요 한. 연구자의 숫자는 환경 요인과 원하는 세포 기능 간의 상관 관계를 조사 하려고 했습니다, 많은 알 수 없는 남아 있다. 이것은 같은 환경 신호에 vitro에, 모방 하 고 셀에 다른 환경 신호를 테스트 하는 동시에 적절 한 방법론의 부족 때문에 크게 이다. 여기, 우리는 미세 채널 및 높은 콘텐츠 단일 셀 분석, 줄기 세포 고기 다른 환경 요인에 의해 변경 될 검사를 다음 nanofiber 배열의 통합된 플랫폼을 보고 합니다. 설명 하기 위해이 플랫폼의 응용 프로그램,이 연구는 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs) 자기 갱신의 고기에 집중 한다. 여기, 우리 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열의 제작에 nanofiber 배열 및 미세 구조에 대 한 준비 절차를 제시. 또한, 프로 파일링, 여러 형광 마커, 여러 형광 이미징, 그리고 통계 분석, 얼룩 셀 단일 셀의 전체 단계 설명 합니다.
Introduction
인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)1,2 자체 unlimitedly 확장 한다 갱신 하 고 신약 개발, 세포 기반 치료, 조직 공학 및 재생 의학 혁명을 수 있는 다양 한 조직 혈통으로 차별화 3 , 4 , 5 , 그러나 6. 일반 문화 요리와 결정 판,, 세포 확장을 위한 중요 한 요소는 정확한 물리적, 화학적 셀 조작 범위의 나노를 마이크로-미터, 세포 수준에서 사용 하도록 설계 되지 않았습니다 셀프-갱신, 그리고 감 별 법입니다. 이 단점을 해결 하기 위해 연구 세포 운명 결정 및 셀 기능4규제에 세포 microenvironments의 역할 조사 했습니다. 최근 몇 년 동안, 연구의 증가7,8 체 외에서세포 microenvironments를 재구성 하기 위해 실시 되었습니다. 나노 및 마이크로 제작 공정 화학9,10,,1112,13의 조작을 통해 이러한 microenvironments 설립 14,15,,1617 및 실제18,,1920 환경 신호. 지금까지 세포 운명 결정 및 단일 플랫폼 내에서 기능에 화학적 및 물리적 환경 단서의 기본 메커니즘을 체계적으로 조사를 보고 했다.
여기에 심플한 디자인 원칙 강력한 심사 플랫폼 (그림 1)을 설정 하는 전략을 소개 합니다. 우리가 nanofiber 배열 및 미세 구조를 사용 하 여 다재 다능 한, 인공 세포 microenvironments를 만들기 위한 통합된 플랫폼의 개발 절차를 설명 하는 첫째,: 더 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 (그림 1A 그리고 2A). Nanofiber 배열 nanofiber 재료와 밀도의 다양 한 조합에서 12 다른 microenvironments를 있다. 전기 조작 nanofibers 하 사용 되었다. 폴리스 티 렌 (PS)21,22, polymethylglutarimide (PMGI) 젤라틴 (GT)23, 같은 nanofiber 재료 세포 접착 및 pluripotency ( 의 유지 보수에 영향을 미칠 수 있습니다 그들의 화학 재산을 테스트 하도록 설계 되었습니다. 그림 2B). Nanofiber 밀도 했다 전기 시간을 변경 하 여 다양 하 고 생성 된 nanofibers 그들의 밀도 따라 정의 된 (DNF, d = XLow/낮은/중간/높은). 미세 구조입니다 (PDMS) 48 세포 배양 챔버, 96-잘 microplate의 표준 치수에 따라 배치 될 수 있습니다 있는 은닉의 구성 됩니다. PDMS는 일반적으로 미세 장치24를 조작 하는 데 사용 하는 생체 및 가스 교환 중합체 이다. 각 미세 채널 설계 되었습니다 700 µ m 폭 및 8.4 m m 길고 가장자리 (표 1)에서 2 개의 후미를 했다. 약 실 다른 고소 했다 (250, 500 및 1000 µ m)에서 초기 셀 시드 밀도 (0.3, 0.6, 1.2 × 105 셀/cm2), 생존, 확산, 그리고 hPSCs25의 연관 시킬 수 있는 조작 (그림 2C). 챔버로 시드 셀 수 챔버 바닥 위에 열 밀도에 비례 이며 따라서 밀도 시드 초기 셀 문화 실로 서로 다른 높이와 동일한 세포 현 탁 액을 도입 하 여 통제 되었다. 모든 채널 ≥ 250 µ m 높이26 셀에 낮은 산소 긴장27 및 전단 응력28 의 효과 최소화 하기 위해 되도록 설계 되었습니다. 250, 500 및 1000 µ m의 채널 높이 여기 약식 x XCD = 낮음, 중간, 그리고 높은, 각각. 고유한 nanofiber 밀도와 초기 셀 시드 밀도 환경 “Material_NF density_Cell 밀도”로 단축 되었다 (예를 들어, GT_HighNF_HighCD: 고밀도 GT nanofibers 및 높은 초기 셀 시드 특징 환경 밀도)입니다.
그 후, 우리는 단일 셀 셀 동작 환경 요인 (그림 1B)에 대 한 응답을 체계적으로 조사 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 의 증거-개념, 우리 식별 hPSC 자체 재생을 위한 최적의 세포 환경 hPSC 유지 보수 (그림 1B)29에 대 한 주요 기능입니다. 이미지 기반 cytometry, 통계 분석, 이어서 세포 환경 개별 세포 phenotypic 응답의 정량적 해석 할 수 있습니다. 다양 한 세포 기능 가운데이 종이 hPSC 자기 갱신을 유지 하기 위한 최적의 조건을 식별 하는 자세한 절차를 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 자격 갖춘된 hPSCs의 유지 보수에 대 한 강력한 문화 시스템 구축 첫 번째 심사 메서드를 보여 줍니다. 첫째, 우리는 다양 한 인공 소프트웨어와 통합 nanofiber 배열, MACME 배열 된 미세 장치를 사용 하 여 밀도 시드 셀 플랫폼을 준비 하는 방법을 설명 합니다. 두 번째, 양적 이미지 기반 단일 셀 형질 개별 세포 결과 및 다른 생 화 확 및 생물 기능에 의해 변경 하는 동작 수행된<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 인간의 ES 세포를 제공 하기 위한 iCeMS, 교토 대학에서 교수 N. 辻를 감사 합니다. 우리는 또한 감사 교수 A. 마루야마 도쿄 기술 연구소에서 원자 힘 현미경의 사용에 그의 지원에 대 한. 자금 아낌없이 제공 했다 일본 사회 과학의 프로 모션에 대 한 (JSP; 22350104, 23681028, 25886006, 및 24656502); 자금 또한 새로운 에너지와 산업 기술 종합 개발 기구 (NEDO)와 Terumo 생명 과학 재단에 의해 제공 했다. WPI iCeMS는 세계 최고의 국제 연구 센터 이니셔티브 (WPI), 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT), 일본에 의해 지원 됩니다. 이 작품의 일부는 교토 대학 나노기술 허브와 AIST 나노 처리 시설 “나노기술 플랫폼 프로젝트” 일본 문 부 과학성의 후원에 의해 지원 되었다.
Materials
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
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