Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado
Summary
Este artigo descreve a metodologia detalhada para preparar uma matriz multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulação de alta produtividade de física e química sugestões imitando na vivo o microambiente celular e para Identifica o ambiente celular ideal para as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) com perfis de célula única.
Abstract
Microambiente celular consiste em uma variedade de pistas, como fatores de crescimento, matrizes extracelulares e interações intercelulares. Estes tacos são bem orquestrados e são fundamentais na regulação de funções de células em um sistema vivo. Embora um número de pesquisadores tentaram investigar a correlação entre fatores ambientais e funções celulares desejadas, muito permanece desconhecido. Isto é principalmente devido a falta de uma metodologia adequada para imitar tais pistas ambientais em vitroe testar simultaneamente diferentes pistas ambientais nas células. Aqui, nós relatamos uma plataforma integrada de canais microfluídicos e uma matriz de nanofibras, seguido de análise de célula única de alto teor, para examinar células estaminais fenótipos alterados por fatores ambientais distintas. Para demonstrar a aplicação desta plataforma, este estudo centra-se sobre os fenótipos de self que renova as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Aqui, apresentamos os procedimentos de preparação para uma matriz de nanofibras e a estrutura de microfluidic na fabricação de uma matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME). Além disso, as etapas gerais da único-célula de criação de perfil, pilha que mancha com vários marcadores fluorescentes, várias imagens de fluorescência e análises estatísticas, são descritas.
Introduction
De1,(hPSCs) as células-tronco pluripotentes humanas2 auto renovar ilimitadamente e se diferenciar em várias linhagens de tecido, que poderiam revolucionar o desenvolvimento de drogas, terapias baseadas em células, engenharia de tecidos e medicina regenerativa 3 , 4 , 5 , 6. pratos de cultura geral e placas de microtitulação, no entanto, não são projetadas para permitir a manipulação de célula precisa de física e química a nível celular, com o intervalo de nano – para micrometros, que é um fator crítico para a expansão celular, auto-renovação e diferenciação. Para resolver este inconveniente, estudos têm investigado os papéis do microambiente celular na regulação da célula-destino decisões e célula funções4. Nos últimos anos, um número crescente de estudos têm sido realizado para reconstruir o microambiente celular em vitro7,8. Processos de fabricação de micro e nano estabeleceram esses microambiente através da manipulação de químicos9,10,11,12,13, 14,15,16,17 e19,de física18,20 pistas ambientais. Até agora, não havia nenhum relatórios sistematicamente, investigar os mecanismos subjacentes de pistas ambientais físicas e químicas na célula destino decisões e funções dentro de uma única plataforma.
Aqui, apresentamos uma estratégia baseada em princípios de design simples, para estabelecer uma plataforma robusta de triagem (Figura 1). Primeiro, descrevemos o processo de desenvolvimento de uma plataforma integrada para a criação artificial, versátil microambiente celular usando uma matriz de nanofibras e uma estrutura de microfluidic: matriz de The multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) (Figura 1A e 2A). A matriz de nanofibras tem 12 microambiente diferentes em diferentes combinações de materiais de nanofibras e densidades. Eletrofiação foi usada para fabricar nanofibras. Os materiais de nanofibras, tais como o poliestireno (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22e gelatina (GT)23, foram projetados para testar suas propriedades químicas, que podem afetar a aderência de célula e manutenção da pluripotência ( Figura 2B). Densidades de nanofibras eram variadas, alterando o tempo de eletrofiação e as gerado nanofibras foram definidas de acordo com suas densidades (DNF, com D = XLow/Low/Mid/High). A estrutura de microfluidic é composta de polidimetilsiloxano (PDMS), abrigando 48 câmaras de cultura de células, que podem ser posicionadas junto as dimensões padrão de microplacas de 96 poços. PDMS é um polímero biocompatível e gás-intercambiáveis, geralmente usado para fabricar de dispositivos microfluídicos24. Cada canal microfluidic foi projetado para ser 700-µm de largura e 8,4 mm de comprimento e tinha duas entradas em suas bordas (tabela 1). As câmaras tinham diferentes alturas (250, 500 e 1000 µm) para manipular as iniciais célula-semeadura densidades (0.3, 0.6 e 1.2 × 105 células/cm2), que podem correlacionar com a sobrevivência, proliferação e diferenciação de hPSCs25 (Figura 2C). O número de células semeado em uma câmara é proporcional a densidade da coluna acima do piso da câmara, e, portanto, célula inicial, densidade de semeadura era controlada por introduzir a mesma suspensão de eritrócitos em câmaras de cultura com diferentes alturas. Todos os canais foram projetados para serem ≥ 250 µm-alta26 para minimizar os efeitos da tensão de oxigênio baixo27 e tensão de cisalhamento28 sobre as células. Alturas de canal de 250, 500 e 1000 µm são abreviadas aqui como XCD com X = Low, Mid e alta, respectivamente. Os ambientes com nanofibras distintas densidades e densidades de semeadura de células iniciais foram encurtados como “Densidade de density_Cell de Material_NF” (por exemplo, GT_HighNF_HighCD: um ambiente caracterizado por nanofibras GT de alta densidade e alta inicial célula-semeadura densidade).
Posteriormente, descrevemos como executar análises de célula única para investigar sistematicamente o comportamento da célula em resposta a fatores ambientais (Figura 1B). Como um prova de conceito, identificamos o ambiente celular ideal para hPSC auto-renovação, que é uma função chave para hPSC manutenção (Figura 1B)29. Citometria baseada em imagem, seguida de análises estatísticas, permite a interpretação quantitativa de respostas fenotípicas celulares individuais para ambientes celulares. Entre uma variedade de funções celulares, este artigo fornece um procedimento detalhado para identificar as condições ideais para a manutenção de hPSC auto-renovação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo demonstra o primeiro método de triagem para estabelecer um sistema robusto de cultura para a manutenção de hPSCs qualificado. Primeiro, descrevemos como preparar uma plataforma com diversos ECMs artificiais e célula densidades de semeadura usando um dispositivo microfluidic integrado com uma matriz de nanofibras, a matriz MACME. Segunda, quantitativa baseada em imagem única célula fenotipagem foi realizada50 para avaliar os resultados individuais de celulares e comportamentos …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o Prof N. Nakatsuji no iCeMS, Universidade de Quioto, para fornecer células ES humanas. Também agradecemos a Prof A. Maruyama no Tokyo Institute of Technology pelo seu apoio na utilização do microscópio de força atômica. O financiamento foi generosamente fornecido pela sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 e 24656502); financiamento também foi fornecido pela nova energia e organização de desenvolvimento de tecnologia Industrial (NEDO) e a Fundação de Ciências da vida Terumo. O iCeMS-WPI é suportado pelo mundo Premier International Research Centre iniciativa (WPI), o Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT), Japão. Uma parte deste trabalho foi apoiada pelo Hub de nanotecnologia de Universidade de Quioto e as instalações de processamento de Nano AIST no projeto”nanotecnologia plataforma” patrocinado pelo MEXT, Japão.
Materials
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
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