Her beskriver vi en protokol for at udføre cisterna magna cannulation (CMc), en minimalt invasiv måde at levere røbestoffer, substrater og signalering molekyler i cerebrospinalvæske (CSF). Kombineret med forskellige billeddiagnostiske modaliteter, muliggør CMc glymphatic system samt CSF dynamics vurdering og hjerne-wide levering af forskellige forbindelser.
Cisterna magna cannulation (CMc) er en enkel procedure, der muliggør direkte adgang til cerebrospinalvæske (CSF) uden udløsende skader på kraniet og hjernen parenkym. I bedøvede gnavere, eksponering af dura mater af stump dissektion af nakkemusklerne gør det muligt for indsættelse af en kanyle i cisterna magna (CM). Kanyle, der består enten af en fin skrå nål eller borosilicate kapillær, er knyttet via en polyethylen (PE) rør til en sprøjte. Ved hjælp af en sprøjte pumpe, kan molekyler derefter blive injiceret til kontrollerede priser direkte i CM, som er sammenhængende med subarachnoidale rum. Fra subarachnoidale rum, kan vi spore CSF strømme af konvektive flow i perivascular plads omkring gennemtrængende arterioler, hvor opløste udveksling med den interstitielle væske (ISF) opstår. CMc kan udføres akut injektioner umiddelbart efter operationen, eller kronisk implantation, med senere injektion i bedøvede eller vågen, frit flytte gnavere. Kvantitering af tracer fordeling i hjernen parenkym kan udføres af epifluorescensmikroskop, 2-foton mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MR), afhængigt af de fysisk-kemiske egenskaber af de injicerede molekyler. Således tilbyder CMc sammenholdt med forskellige Billeddannende teknikker et stærkt værktøj til vurdering af glymphatic system og CSF dynamik og funktion. Derudover kan CMc udnyttes som en kanal for hurtig, hjerne-wide levering af signalering molekyler og metaboliske substrater, der ellers ikke kunne krydse blod-hjerne barrieren (BBB).
Cerebrospinalvæske (CSF) bader det centrale nervesystem (CNS) i hele den ventrikulære systemet og langs de subarachnoidale rum, et anatomisk defineret plads i kontinuum med hjertekamrene, der omgiver hjernen og rygmarven. En af de vigtigste funktioner af CSF er at skabe en rute for clearance af metabolitter og opløste stoffer fra hjernen parenkym. Clearance lettes via det nyligt opdagede glymphatic system1, hjernen analog til det perifere lymfesystemet. Heri, vi beskrive og diskutere cisterna magna cannulation (CMc), en minimalt invasiv metode for den direkte levering af molekyler i EFSR’EN. CMc er den vigtigste metode til at studere funktionen glymphatic. CMc kan desuden også anvendes til studiet af CSF dynamics og en hurtig, hjerne-wide levering af ikke-blod-hjerne barrieren (BBB) gennemtrængelig molekyler i hjernen parenkym, langs perivascular pladsen.
CMc udnytter fysiologiske principper af CSF bevægelse dynamikken gennem CNS levere mærket tracer molekyler eller narkotika ind i CSF-fyldte rummet cisterna Magna (CM). Molekyler er injiceres gennem en kanyle implanteres i den atlanto-occipital dural membran dækker CM. molekyler transporteres derefter af CSF bulk flow til hjernen parenkym via paravascular plads1. Tracer eller kontrast agent injiceret via CMc følger flytning af CSF, hvilket giver mulighed for vurdering af CSF bevægelse og glymphatic tilstrømning af kvantificere intensitet niveauer af mærket molekyler, som angiver hjernen parenkym. CMc er kompatibel med forskellige Billeddannende teknikker herunder epifluorescensmikroskop, 2-foton mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MR). Denne vurdering kan også udføres både i vivo eller ex vivo. Vigtigere, CMc giver mulighed for visualisering af glymphatic systemet under anæstesi eller under naturlig søvn og vågen, frit bevægelige dyr.
CMc teknik kan udnyttes til at studere forskellige aspekter af fluid dynamik i EFSR’EN, men har vist sig for at være særdeles nyttigt for at studere glymphatic system. Glymphatic aktivitet drev den konvektive strømmen af CSF fra periarterial plads via aquaporin-4 (AQP-4) vandkanaler, som er bundet i membranen af astrocytic kar-indpakning endfeet. Den konvektive flow muliggør udveksling af CSF og interstitiel væske (ISF) i hjernen parenkym. CSF/ISF indeholdende metaboliske affald og opløste stoffer er derefter fjernet fra hjernen parenkym via perivenous plads2,3. I sidste ende, når CSF/ISF periferi via for nylig beskrevet dural lymfekar4,5. Glymphatic system har vist afgørende for regnskabsafslutningen for skadelige affald metabolitter som amyloid-β2. Yderligere, glymphatic clearance er nedsat i aging6, efter traumatisk hjerne skade7, og i dyremodeller for diabetes8 og Alzheimers sygdom9. Især, er glymphatic aktivitet staten afhængige, viser betydeligt højere aktivitet under søvn eller anæstesi i forhold til vågenhed1. Ja, unge bedøvede dyr udviser den højeste glymphatic aktivitet. Eksperimentelle kvantificering af glymphatic aktivitet er således kritisk, når man studerer sin rolle i sundhed og sygdom.
Flere undersøgelser har behandlet CSF dynamik og dets omstigning til interstitiel væske (ISF) i hjernen parenkym. Metoderne af der mærkede molekyler er leveret er dog snarere invasive, udløser hjernen parenkym skader og ændringer i den intrakranielt tryk (ICP) (Se anmeld10). Nogle eksempler er intraventrikulært eller intraparenchymal injektioner, som involverer kraniotomi eller boring af en burr hul i kraniet. Disse procedurer har vist sig at ændre ICP, dermed forstyrre glymphatic funktion2. Også sådanne invasive metoder, der fremkalde astrogliosis og øge AQP-4 immunoreactivity i hjernen parenkym beskadiget område og dets omgivelser11,12. Astrocytter og AQP-4 er centrale elementer i glymphatic systemet, er CMc den foretrukne metode for sine undersøgelser. De store fordele ved CMc i forhold til mere invasive procedurer er opretholdelse af en intakt kraniet og hjernen parenkym, undgå ICP ombygninger og astrogliosis, henholdsvis. Således åbner CMc sammenholdt med forskellige afbildningsværktøjer for en bred vifte af muligheder for at studere ikke blot glymphatic systemet, men også dynamikken og mekanismer af flydende flow i homøostase, såvel som i dyremodeller for neurologiske sygdomme.
Cisterna magna cannulation (CMc) procedure giver nem og direkte adgang til cerebrospinalvæske (CSF). Ved indblæsning af forskellige molekyler (fx fluorescerende sporstoffer, MR-kontrastmidler) kan eksperimentatoren spore deres bevægelser inden for CSF rum og vurdere aktiviteten af glymphatic systemet. Følgende protokol beskriver både den akutte CMc, for injektioner umiddelbart efter operationen, og kronisk implantation af kanyle, hvori dyret genindvinder fra den kirurgiske procedure for en senere injektion. Den vigtigste forskel mellem akut og kronisk implantation er, at den kroniske implantation giver mulighed for undersøgelse af glymphatic aktivitet i vågen mus.
Vi har præsenteret en protokol, der beskriver en detaljeret procedure for cisterna magna cannulation (CMc), som tilbyder en enkel metode til at levere mærket molekyler til CSF rum. CMc tillader den efterfølgende visualisering af CSF dynamics, både i vivo og ex vivo, ved hjælp af forskellige billeddiagnostiske modaliteter eller histologi.
En af de vigtigste fordele ved CMc teknik ligger i direkte adgang til den subarachnoidale rum uden at udsætte hjernen ved kraniotomi. …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Novo Nordisk Fonden og nationale Institut for neurologiske forstyrrelser og slagtilfælde, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. og Lizettes-R er modtagere af en postdoc stipendium og et PhD legat fra Lundbeckfonden, henholdsvis.
SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
Eye spears | Medicom | A18005 | |
Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |