Kanüle Implantation in die Cisterna Magna von Nagetieren
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Durchführung der Cisterna Magna Kanülierung (CMc), minimalinvasiv, Tracer, Substrate und Signalmoleküle in den Liquor cerebrospinalis (CSF) zu liefern. In Kombination mit verschiedenen Bildgebungsverfahren ermöglicht CMc Glymphatic System sowie CSF Dynamik Bewertung und Gehirn-weite Lieferung verschiedener Verbindungen.
Abstract
Cisterna Magna Kanülierung (CMc) ist ein einfaches Verfahren, das direkten Zugriff auf die cerebrospinale Flüssigkeit (CSF) ohne operativen Schäden an den Schädel oder das Gehirn Parenchym ermöglicht. Bei anästhesierten Nagetieren ermöglicht die Belichtung der Dura Mater durch stumpfe Dissektion der Nackenmuskulatur das einführen der Kanüle in die Cisterna Magna (CM). Die Kanüle, komponiert, entweder durch einen feinen abgeschrägten Nadel oder Borosilikatglas Kapillare, ist über einen Schlauch Polyethylen (PE) eine Spritze befestigt. Über eine Spritzenpumpe, können Moleküle dann kontrollierten Preisen direkt in die CM injiziert werden kontinuierlich mit den Subarachnoidalraum ist. Aus dem Subarachnoidalraum können wir CSF Fluten durch konvektive Strömung in den perivaskulärer Raum um eindringende Arteriolen verfolgen, wo gelöste Austausch mit der interstitiellen Flüssigkeit (ISF) erfolgt. CMc kann für akute Injektionen unmittelbar nach der Operation oder für eine chronische Implantation, mit späteren Injektion betäubt oder wach, erfolgen frei beweglichen Nagetiere. Quantifizierung der tracerverteilung im Gehirn Parenchym erfolgt durch Epifluoreszenz, 2-Photonen-Mikroskopie und Magnetresonanz-Bildgebung (MRI), abhängig von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der injizierten Moleküle. CMc in Verbindung mit verschiedenen bildgebenden Verfahren bietet damit ein leistungsfähiges Werkzeug für die Beurteilung des Glymphatic Systems und CSF Dynamik und Funktion. CMc kann darüber hinaus genutzt werden, als Kanal für schnelle, Gehirn-weite Lieferung der Signalisierung Moleküle und metabolische Substrate, die die Blut-Hirn-Schranke (BBB) sonst nicht überqueren konnte.
Introduction
Liquor cerebrospinalis (CSF) taucht das zentrale Nervensystem (ZNS) in das Ventrikelsystem und entlang der Subarachnoidalblutung Räume, ein anatomisch definierten Raum im Kontinuum mit der Ventrikel, die das Gehirn und das Rückenmark umgibt. Eine der Hauptfunktionen des GFK ist eine Route für die Abfertigung von Metaboliten und gelösten Stoffen aus der Anwesenheit von zur Verfügung zu stellen. Abstand wird über die kürzlich entdeckten Glymphatic System1, das Gehirn, die analog zu den peripheren lymphatischen Systems erleichtert. Hierin, wir beschreiben und erläutern die Cisterna Magna Kanülierung (CMc), eine minimal-invasive Methode für die direkte Übergabe von Molekülen in den Liquor. CMc ist die zentrale Methode zur Untersuchung der Glymphatic-Funktion. CMc kann darüber hinaus auch für das Studium der CSF Dynamik und für eine schnelle, Gehirn-weite Lieferung nicht Blut Hirn-Schranke (BBB) durchlässig Moleküle in das Gehirn Parenchym, entlang der perivaskulärer Raum angewendet werden.
Die CMc nutzt physiologische Grundsätze der CSF Bewegungsdynamik durch die CNS, beschriftete Tracer Moleküle oder Drogen in den CSF gefüllten Raum der Cisterna Magna (CM) zu liefern. Moleküle sind über eine Kanüle in die Atlas-okzipitalen dural Membran-Abdeckung, die die CM. Moleküle dann von CSF Masse fließen über den Paravascular Platz1in der Anwesenheit durchgeführt werden implantiert eingespritzt. Tracer oder Kontrast-Agent über die CMc injiziert folgt der Bewegung des CSF, wodurch die Beurteilung der CSF Bewegung und Glymphatic Zustrom durch Quantifizierung Intensitätsstufen beschrifteten Moleküle, die die Anwesenheit von eingeben. CMc ist kompatibel mit verschiedenen bildgebenden Verfahren einschließlich Epifluoreszenz, 2-Photonen-Mikroskopie und Magnetresonanz-Bildgebung (MRI). Auch diese Beurteilung kann in Vivo und ex Vivodurchgeführt. Wichtig ist, ermöglicht CMc die Visualisierung des Systems der Glymphatic unter Narkose oder im natürlichen Schlaf sowie bei wachen, frei beweglichen Tieren.
Die CMc-Technik kann genutzt werden, um verschiedene Aspekte der Strömungsmechanik im Liquor zu studieren, sondern erweist sich als besonders nützlich für das Studium des Glymphatic-Systems sein. Glymphatic Aktivität treibt die konvektive Strömung von CSF aus dem Periarterial Raum über Wasserkanäle Aquaporin-4 (AQP-4), die in der Membran der astrocytic vaskulären Umhüllung Endfeet angebunden sind. Die konvektive Strömung ermöglicht den Austausch von CSF und interstitielle Flüssigkeit (ISF) in das Gehirn Parenchym. CSF/ISF, Stoffwechselschlacken und gelösten Stoffen enthalten wird dann aus der in Anwesenheit von über den perivenöse Platz2,3entfernt. Letzten Endes erreicht CSF/ISF die Peripherie über die kürzlich beschriebenen dural Lymphgefäße4,5. Das Glymphatic System wurde entscheidend für die Abfertigung von schädlichen Abfällen Metaboliten wie Amyloid-β2gezeigt. Darüber hinaus ist Glymphatic Clearance beeinträchtigt Altern6, nach Schädel-Hirn-Verletzung-7, und in Tiermodellen der Diabetes-8 und der Alzheimer-Krankheit9. Bemerkenswert ist Glymphatic Aktivität Zustand abhängig, während Schlaf oder Anästhesie im Vergleich zu Wachheit1deutlich höheren Aktivität zeigen. In der Tat zeigen junge narkotisierten Tiere die höchste Glymphatic-Aktivität. Experimentellen Quantifizierung der Glymphatic Tätigkeit ist somit entscheidend ihre Rolle in Gesundheit und Krankheit zu studieren.
Mehrere Studien haben CSF Dynamik und ihren Austausch mit interstitielle Flüssigkeit (ISF) in das Gehirn Parenchym angesprochen. Die Methoden, die durch die beschrifteten Moleküle geliefert werden sind jedoch eher invasiv, Hirnschäden Parenchym und Änderungen in der intrakraniellen Druck (ICP) auslösen (siehe Bewertung10). Einige Beispiele sind intraventrikuläre oder Intraparenchymal Einspritzungen die Kraniotomie oder Bohren von einen Grat beinhalten Loch in den Schädel. Diese Verfahren wurden gezeigt, ICP, so stören Glymphatic Funktion2zu ändern. Auch solche invasiven Methoden induzieren Astrogliosis und AQP-4 Immunoreactivity in dem Hirnareal Parenchym beschädigt und seine Umgebung11,12zu erhöhen. Wie Astrozyten und AQP-4 Schlüsselelemente des Glymphatic Systems, ist die CMc die Methode der Wahl für seine Studien. Die wichtigsten Vorteile von CMc im Vergleich zu mehr invasiven Verfahren sind die Aufrechterhaltung einer intakten Schädel und Gehirn Parenchym, ICP Umbauten und Astrogliosis, bzw. zu vermeiden. So öffnet CMc in Verbindung mit anderen imaging-Tools für eine breite Palette von Möglichkeiten, nicht nur das Glymphatic-System, sondern auch die Dynamik zu studieren und Mechanismen der Flüssigkeitsströmung in Homöostase sowie in Tiermodellen der neurologischen Erkrankungen.
Cisterna Magna Kanülierung (CMc) Verfahren ermöglicht einfachen und direkten Zugriff auf die cerebrospinale Flüssigkeit (CSF). Durch die Injektion von verschiedener Molekülen (z.B. Fluoreszenz Tracer, MRT-Kontrastmittel) kann der Experimentator verfolgen ihre Bewegung innerhalb der CSF-Fach und die Aktivität des Glymphatic Systems zu bewerten. Das folgende Protokoll beschreibt sowohl die akuten CMc für Injektionen unmittelbar nach der Operation, und chronische Implantation der Kanüle, in der das Tier erholt sich von dem chirurgischen Eingriff für eine spätere Injektion. Der wichtigste Unterschied zwischen der akuten und chronischen Implantation ist, dass die chronische Implantation für das Studium der Glymphatic Aktivität bei Mäusen wach.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben ein Protokoll vorgelegt, die ein detailliertes Verfahren für Cisterna Magna Kanülierung (CMc), die bietet eine einfache Methode beschreibt um markierte Moleküle an das CSF-Fach zu liefern. CMc ermöglicht die spätere Visualisierung der CSF Dynamik, in Vivo und ex Vivo, mittels verschiedener bildgebender Verfahren oder Histologie.
Einer der Hauptvorteile der CMc-Technik liegt in einen direkten Zugang zum Subarachnoidalraum ohne die Notwendigkeit, das Gehirn von K…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Novo Nordisk Stiftung und National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall, NINDS/NIH (M.N) unterstützt. A.L.R.X. und S.H-R sind Empfänger von ein Postdoc-Stipendium und ein Promotionsstipendium der Lundbeck-Stiftung.
Materials
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
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