Cânula de implantação para a Cisterna Magna de roedores
Summary
Aqui descrevemos um protocolo para realizar a cateterização da cisterna magna (CMc), uma forma minimamente invasiva para entregar traçadores, substratos e moléculas sinalizadoras no fluido cerebrospinal (CSF). Combinado com diferentes modalidades de imagem, CMc permite sistema de glymphatic e avaliação de dinâmica do CSF, bem como a entrega de todo o cérebro de vários compostos.
Abstract
Canulação de cisterna magna (CMc) é um procedimento simples que permite acesso direto para o líquido cefalorraquidiano (CSF) sem danos operativo para o crânio ou o parênquima cerebral. Em roedores anestesiados, a exposição da dura-máter por dissecção romba dos músculos do pescoço permite a inserção de uma cânula para a cisterna magna (CM). A cânula, composta por uma agulha fina chanfrada ou borosilicato capilar, está ligada através de um tubo de polietileno (PE) com uma seringa. Usando uma bomba de seringa, moléculas podem então ser injetadas em taxas controladas diretamente o CM, que é contínua com o espaço subaracnoideo. Partir do espaço subaracnoideo, poderemos rastrear fluxos CSF pelo fluxo convectivo no espaço perivascular em torno de arteríolas penetrantes, onde ocorre a troca de soluto com o fluido intersticial (ISF). CMc pode ser realizada por injeções agudas, imediatamente após a cirurgia, ou para implantação de crônica, com posterior injeção em anestesiados ou acordado, movimentando-se livremente roedores. Quantificação da distribuição do traçador no parênquima cerebral pode ser executada por epifluorescência, 2-fotão microscopia e ressonância magnética (MRI), dependendo das propriedades físico-químicas das moléculas injetadas. Assim, o CMc em conjunto com várias técnicas de imagem oferece uma poderosa ferramenta para avaliação do sistema de glymphatic e dinâmica do CSF e função. Além disso, a CMc pode ser utilizada como um canal para entrega rápida, todo o cérebro de sinalização moléculas e substratos metabólicos que caso contrário não atravessar a barreira hemato-encefálica (BBB).
Introduction
Líquido cefalorraquidiano (CSF) banha o sistema nervoso central (SNC) em todo o sistema ventricular e ao longo dos espaços subaracnoide, um espaço anatomicamente definido no continuum com os ventrículos, que envolve o cérebro e a medula espinhal. Uma das principais funções do QCA é fornecer uma rota para apuramento dos metabolitos e solutos do parênquima cerebral. Acesso é facilitado através da glymphatic recentemente descoberto sistema1, o cérebro analógico para o sistema linfático periférico. Neste documento, podemos descrever e discutir a canulação cisterna magna (CMc), um método minimamente invasivo para a entrega direta de moléculas para o CSF. CMc é o método principal para estudar a função glymphatic. Além disso, CMc também pode ser aplicado para o estudo da dinâmica do CSF e para uma entrega rápida, todo o cérebro de moléculas permeável do cérebro não-sangue barreira (BBB) para o parênquima cerebral, ao longo do espaço perivascular.
O CMc explora princípios fisiológicos da dinâmica de movimento CSF através do CNS para entregar o palpador rotulado moléculas ou drogas para o espaço cheio de CSF da cisterna magna (CM). Moléculas são injetadas através de uma cânula implantada para a cobertura de dura-máter membrana atlanto-occipital, que as moléculas CM. em seguida são transportadas por fluxo de massa CSF para o parênquima cerebral através do paravascular espaço1. Agente de marcador ou contraste injetado através do CMc segue o movimento do CSF, que permite a avaliação da circulação do CSF e influxo de glymphatic através da quantificação de níveis de intensidade de moléculas rotulados que insira o parênquima cerebral. CMc é compatível com diferentes técnicas de imagem, incluindo epifluorescência, 2-fotão microscopia e ressonância magnética (MRI). Além disso, esta avaliação pode ser realizada tanto em vivo ou ex vivo. Importante, CMc permite a visualização do sistema de glymphatic sob anestesia ou durante o sono natural, assim como em animais acordados, andando livremente.
A técnica de CMc pode ser utilizada para estudar os diferentes aspectos da dinâmica dos fluidos no CSF, mas provou para ser particularmente útil para estudar o sistema de glymphatic. Glymphatic atividade impulsiona o fluxo convectivo de LÍQUOR do espaço periarterial através de canais de água aquaporina-4 (AQP-4), que são amarrados na membrana dos hamartomas vasculares quebra automática de endfeet. O fluxo convectivo permite o intercâmbio de CSF e fluido intersticial (ISF) dentro do parênquima cerebral. CSF/ISF contendo solutos e resíduos metabólicos é então removido o parênquima cerebral através do espaço de perivenous2,3. Finalmente, a CSF/ISF alcança a periferia através de vasos linfáticos dural recentemente descrito4,5. O sistema glymphatic foi mostrado crucial para a habilitação de metabolitos resíduos prejudiciais tais como β-amiloide2. Além disso, glymphatic afastamento é prejudicado no envelhecimento6, depois de lesão cerebral traumática7e em modelos animais de diabetes8 e a doença de Alzheimer9. Nomeadamente, glymphatic atividade é estado dependente, mostrando atividade significativamente maior durante o sono ou anestesia em comparação com a vigília1. De fato, animais anestesiados jovens apresentam a mais alta atividade de glymphatic. Assim, a quantificação experimental da atividade glymphatic é crítica quando estudando o seu papel na saúde e na doença.
Vários estudos têm abordado CSF dinâmica e seu intercâmbio com o líquido intersticial (ISF) no parênquima cerebral. No entanto, os métodos pelos quais moléculas etiquetadas são entregues são bastante invasivos, provocando dano do parênquima cerebral e alterações na pressão intracraniana (ICP) (ver revisão10). Alguns exemplos são intraventricular ou injeções difuso que envolvem craniotomia ou perfuração de uma rebarba do furo no crânio. Esses procedimentos foram mostrados para alterar o ICP, rompendo assim a glymphatic função2. Além disso, tais métodos invasivos induzem astrogliosis e aumentam imunorreatividade AQP-4 na área danificada de parênquima cerebral e seus arredores11,12. Como astrócitos e AQP-4 são elementos-chave do sistema de glymphatic, o CMc é o método de escolha para seus estudos. As principais vantagens do CMc em comparação com procedimentos invasivos mais são a manutenção de uma parênquima de crânio e cérebro intacta, evitando alterações de ICP e astrogliosis, respectivamente. Assim, o CMc em conjunto com diferentes ferramentas de imagem abre para uma ampla gama de possibilidades para estudar não só o sistema de glymphatic, mas também a dinâmica e os mecanismos de fluxo de fluido na homeostase, bem como em modelos animais de doenças neurológicas.
O procedimento de cateterização (CMc) cisterna magna permite acesso fácil e direto para o líquido cefalorraquidiano (CSF). Através da injeção de moléculas diferentes (por exemplo, marcadores fluorescentes, agentes de contraste MRI) o experimentador pode acompanhar o seu movimento no interior do compartimento do CSF e avaliar a atividade do sistema glymphatic. O protocolo seguinte descreve ambos o CMc aguda, para injeções imediatamente após a cirurgia e implantação crônica da cânula, em que o animal se recupera do procedimento cirúrgico para uma posterior injeção. A diferença mais importante entre a implantação aguda e crônica é que a implantação crônica permite o estudo da atividade glymphatic em ratos acordados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós apresentamos um protocolo que descreve um procedimento detalhado para canulação de magna cisterna (CMc), que oferece um método simples para entregar rotulado de moléculas para o compartimento do CSF. CMc permite a visualização posterior da dinâmica do CSF, tanto in vivo e ex vivo, usando diferentes modalidades de imagem ou histologia.
Uma das principais vantagens da técnica da CMc reside no seu acesso direto para o espaço subaracnoide sem a necessidade de expor …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Novo Nordisk Foundation e Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. e Samões-R são beneficiários de uma bolsa de pós-doutorado e uma bolsa de doutoramento da Fundação Lundbeck, respectivamente.
Materials
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -. A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE–the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
