Kanyl Implantation i Cisterna Magna gnagare
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att utföra cisterna magna kanylering (CMc), ett minimalt invasivt sätt att leverera spårämnen, substrat och signalmolekyler i cerebrospinalvätskan (CSF). CMc i kombination med olika avbildningsmetoder, och möjliggör glymphatic system och CSF dynamics bedömning, samt hjärnan-omfattande leverans av olika föreningar.
Abstract
Cisterna magna kanylering (CMc) är en enkel procedur som ger direkt åtkomst till cerebrospinalvätska (CSF) utan operativa skador på skallen eller hjärnparenkymet. I sövda gnagare tillåter exponeringen av dura mater av trubbig dissektion av nackmusklerna införandet av en kanyl i cisterna magna (CM). Kanylen, består antingen av en fin avfasade nål eller Borsilikat kapillär, bifogas en spruta via ett rör av polyeten (PE). Använder en sprutpump, kan molekyler sedan injiceras på kontrollerade priser direkt i den CM, som är kontinuerlig med subaraknoidalrummet. Från subaraknoidalrummet, kan vi spåra CSF flöden av konvektiv flöde in i perivaskulär utrymmet runt genomträngande arterioler, där koncentrationsgradient utbyte med interstitiell vätska (ISF) uppstår. CMc kan utföras för akut injektioner direkt efter operationen, eller kronisk implantation, med senare injektion i sövda eller vaken, fritt rörliga gnagare. Kvantitering av tracer distribution i hjärnparenkymet kan utföras av epifluorescence, 2-foton mikroskopi och magnetisk resonanstomografi (MRT), beroende på fysikalisk-kemiska egenskaper av de injicerade molekylerna. Således erbjuder CMc i samband med olika avbildningstekniker ett kraftfullt verktyg för bedömning av glymphatic system och CSF dynamiken och funktion. CMc kan dessutom användas som en kanal för snabb, hjärnan-omfattande leverans av signalering molekyler och metaboliska substrat som inte annars kunde korsa blod-hjärnbarriären (BBB).
Introduction
Cerebrospinalvätska (CSF) badar det centrala nervsystemet (CNS) i hela den ventrikulära systemet och längs den subaraknoidal utrymmen, ett anatomiskt definierade utrymme i kontinuum med ventriklarna, som omger hjärnan och ryggmärgen. En av de viktigaste funktionerna i GSR är att ge en väg för clearance av metaboliter och föroreningar från hjärnparenkymet. Clearance underlättas via den nyupptäckta glymphatic system1, hjärnan analog till perifera lymfsystemet. Häri, vi beskriva och diskutera den cisterna magna kanylering (CMc), en minimalt invasiv metod för direkt distribution av molekyler i GSR. CMc är den viktigaste metoden för att studera funktionen glymphatic. Dessutom kan CMc också tillämpas för studiet av CSF dynamiken och för en snabb, hjärnan-omfattande leverans av icke-blood brain barrier (BBB) genomsläpplig molekyler i hjärnparenkymet, längs perivaskulär utrymmet.
CMc utnyttjar fysiologiska principer av CSF rörelse dynamik genom CNS att leverera märkt tracer molekyler eller droger i CSF-fyllda utrymmet i cisterna magna (CM). Molekyler injiceras via en kanyl som implanteras i atlantoskandisk-occipital dural membran beläggningen CM. molekylerna transporteras sedan med CSF bulkflöde in i hjärnparenkymet via paravascular utrymme1. Tracer eller kontrast agent injiceras via CMc följer rörelsen av CSF, vilket gör bedömningen av CSF rörelse och glymphatic tillströmning av kvantifiera intensitetsnivåer märkta molekyler som anger hjärnparenkymet. CMc är kompatibel med olika avbildningstekniker inklusive epifluorescence, 2-foton mikroskopi och magnetisk resonanstomografi (MRT). Denna bedömning kan också utföras både i vivo eller ex vivo. Ännu viktigare, möjliggör CMc visualisering av glymphatic systemet under narkos eller under naturlig sömn, samt i vaken, fritt rörliga djur.
CMc tekniken kan utnyttjas för att studera olika aspekter av fluid dynamics i CSF, men har visat sig vara särskilt användbar för att studera det glymphatic systemet. Glymphatic verksamhet driver konvektiv flödet av CSF från periarterial rymden via akvaporin-4 (AQP-4) vattenkanaler, som är bundna i membranet i astrocytic vaskulär-wrapping endfeet. Konvektiv flödet möjliggör utbyte av CSF och interstitiell vätska (ISF) inom hjärnparenkymet. CSF/ISF som innehåller metaboliska avfall och föroreningar tas sedan bort från hjärnparenkymet via perivenous utrymme2,3. Slutligen når CSF/ISF periferin via den nyligen beskriven dural lymfkärl4,5. Glymphatic systemet har visats avgörande för clearance av skadligt avfall metaboliter såsom amyloid-β2. Vidare, glymphatic clearance är nedsatt i åldrande6, efter traumatisk hjärnskada skada7, och i djurmodeller för diabetes8 och Alzheimers sjukdom9. Särskilt är glymphatic aktivitet staten beroende, visar betydligt högre aktivitet under sömn eller anestesi i jämförelse med vakenhet1. Faktiskt, unga sövda djur uppvisar den högsta glymphatic-aktiviteten. Experimentell kvantifiering av glymphatic verksamhet är alltså kritisk när man studerar dess roll vid hälsa och sjukdom.
Flera studier har behandlat CSF dynamiken och dess utbyte med interstitiell vätska (ISF) i hjärnparenkymet. De metoder som levereras märkta molekyler är dock ganska invasiv, utlöser parenkymet hjärnskador och förändringar i det intrakraniella trycket (ICP) (se granska10). Några exempel är intraventrikulär eller intraparenchymal injektioner som innebär kraniotomi eller borrning av en burr hål i skallen. Dessa förfaranden har visat sig förändra ICP, således störa glymphatic funktion2. Även sådana invasiva metoder inducera astrogliosis och öka AQP-4 immunoreaktivitet i hjärnparenkymet skadade området och dess omgivningar11,12. Som astrocyter och AQP-4 är viktiga inslag i det glymphatic systemet, är CMc metoden för val av dess studier. De stora fördelarna med CMc jämfört med mer invasiva ingrepp är upprätthållandet av en intakt skallen och hjärnan parenkymet, undvika ICP förändringar och astrogliosis, respektive. Således, CMc i samband med olika avbildningsverktyg öppnar för ett brett utbud av möjligheter att studera inte bara det glymphatic systemet, utan också dynamiken och verkningsmekanismer vätskeflöde i homeostas, liksom i djurmodeller av neurologiska sjukdomar.
Det cisterna magna kanylering (CMc) förfarandet tillåter enkel och direkt tillgång till cerebrospinalvätska (CSF). Genom att injicera olika molekyler (t.ex. fluorescerande spårämnen, MRI kontrastmedel) kan försöksledaren spåra deras rörlighet inom CSF facket och bedöma aktiviteten av glymphatic systemet. Följande protokoll beskriver både akut CMc, för injektioner direkt efter operationen, och kronisk implantation av kanylen, där djuret återvinner från det kirurgiska ingreppet för senare injektion. Den viktigaste skillnaden mellan akut och kronisk implantation är att kronisk implantation tillåter för studien av glymphatic aktivitet i vaken möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har lagt fram ett protokoll som beskriver ett detaljerat förfarande för cisterna magna kanylering (CMc), som erbjuder en enkel metod för att leverera märkta molekyler i CSF-facket. CMc tillåter efterföljande visualisering av CSF dynamiken, både i vivo och ex vivo, använder olika avbildningsmetoder eller histologi.
En av de främsta fördelarna med CMc tekniken ligger i dess direkt tillgång till subaraknoidalrummet utan att behöva exponera hjärnan av kraniotomi. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av de Novo Nordisk Foundation och nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. och Elias-R är mottagare av ett postdoktorsstipendium och PhD stipendium från stiftelsen Lundbeck, respektive.
Materials
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -. A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE–the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
