Kanyle implantasjon i Cisterna Magna av gnagere
Summary
Her beskriver vi en protokoll for å utføre cisterna magna cannulation (CMc), en minimal invasiv måte å levere tracers, underlag og signalnettverk molekyler i spinalvæske (CSF). CMc kombinert med ulike modaliteter for bildebehandling, og kan glymphatic systemet og CSF dynamics vurdering, samt hjernen hele levering av ulike forbindelser.
Abstract
Cisterna magna cannulation (CMc) er en enkel prosedyre som gir direkte tilgang til spinalvæske (CSF) uten operative skade på skallen og hjernen parenchyma. I bedøvet gnagere tillater eksponering av dura mater av sløv Disseksjon av innsetting av en kanyle i cisterna magna (CM). Kanyle, består av en tynn skrå nål eller borosilicate kapillære, er tilknyttet via en polyetylen rør montering. Bruker en sprøytepumpe, sprøytes molekylene deretter på kontrollert priser direkte inn CM, som er kontinuerlig med subarachnoid space. Fra subarachnoid space, kan vi spore CSF flukser av konvektive strømme inn perivascular plass rundt gjennomtrengende arterioler, der stoff utveksling med interstitiell væske (ISF) oppstår. CMc kan utføres for akutt injeksjoner umiddelbart etter kirurgi eller kronisk implantasjon, med senere injeksjon i bedøvet eller våken, fritt flytte gnagere. Kvantifisering av tracer distribusjon i hjernen parenchyma kan utføres av epifluorescence, 2-fotonet mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MRI), avhengig av egenskapene fysikalsk-kjemiske injisert molekyler. Dermed gir CMc sammen med ulike Bildeteknikker et kraftig verktøy for vurdering av glymphatic systemet og CSF dynamikk og funksjon. Videre kan CMc benyttes som en kanal for rask, hjernen hele levering signalnettverk molekyler og metabolske underlag som ikke ellers kunne krysse blod-hjernebarrieren (BBB).
Introduction
Cerebrospinalvæske (CSF) bader sentralnervesystemet (CNS) i ventrikkel systemet og langs subarachnoid områder, en anatomisk definerte plass i sammenheng med ventriklene, som omgir hjernen og ryggmargen. En av Hovedfunksjonene til CSF er å gi en rute for klarering av metabolitter og solutes fra hjernen parenchyma. Klaring muliggjøres via den nylig oppdaget glymphatic system1, hjernen analog til eksterne lymfesystemet. Her, vi beskriver og diskuterer cisterna magna cannulation (CMc), en minimal invasiv metode for direkte levering av molekyler i CSF. CMc er den viktigste metoden for å studere funksjonen glymphatic. Videre kan CMc også bli brukt for studiet av CSF dynamikken og en rask, hjernen hele levering av ikke-blod-hjerne barrieren (BBB) permeable molekyler i hjernen parenchyma, langs perivascular plassen.
CMc utnytter psykologiske prinsippene av CSF bevegelse dynamics gjennom CNS å levere merket tracer molekyler eller narkotika inn i fylt med CSF løpet av cisterna magna (CM). Molekyler er injisert gjennom en kanyle implantert i den atlanto-tilpassing dural membran dekket CM. molekyler blir deretter utført av CSF bulk flyte inn i hjernen parenchyma via paravascular plass1. Tracer eller kontrast agent inn i CMc følger CSF, hvilke innrømmer vurdering av CSF bevegelse og glymphatic tilstrømningen av kvantifisere intensitetsnivåer merket molekyler angir hjernen parenchyma. CMc er kompatibel med forskjellige Bildeteknikker inkludert epifluorescence, 2-fotonet mikroskopi og magnetisk resonans imaging (MRI). Også denne vurderingen kan være utført både i vivo eller ex vivo. Viktigere, gir CMc effekten av glymphatic under narkose eller under naturlig søvn og våken, fritt bevegelige dyr.
CMc teknikken kan benyttes for å studere ulike aspekter av fluid dynamikk i CSF, men har vist seg for å være spesielt nyttig for å studere glymphatic systemet. Glymphatic stasjoner konvektive flyten av CSF fra feltet periarterial via aquaporin-4 (AQP-4) vannkanaler, som er bundet i membranen av astrocytic vaskulære-innpakning endfeet. Konvektive flyten muliggjør utveksling av CSF og interstitiell væske (ISF) i hjernen parenchyma. CSF/ISF inneholder metabolsk avfall og solutes så blir fjernet fra hjernen parenchyma via perivenous plass2,3. Til slutt, når CSF/ISF periferien via nylig beskrevet dural lymfekar4,5. Glymphatic systemet har vist avgjørende klarering av skadelige avfall metabolitter som amyloid-β2. Videre er glymphatic klaring nedsatt i aldring6, etter traumatisk brain skader7, og dyr modeller av diabetes8 og Alzheimers9. Spesielt er glymphatic aktivitet avhengige, viser betydelig høyere aktivitet under søvn eller anestesi i forhold til våkenhet1. Faktisk viser unge bedøvet dyr høyeste glymphatic aktiviteten. Dermed er eksperimentelle kvantifisering av glymphatic aktivitet kritisk når studere sin rolle i helse og sykdom.
Flere studier har adressert CSF dynamikk og dens utveksling med interstitiell væske (ISF) i hjernen parenchyma. Men metodene som leveres merket molekyler er ganske invasiv, utløser parenchyma hjerneskade og endringer i hjernetrykk (ICP) (se gjennom10). Noen eksempler er intraventricular eller intraparenchymal injeksjoner som involverer craniotomy eller boring av en burr hull i skallen. Disse prosedyrene har blitt vist å endre ICP, dermed forstyrre glymphatic funksjon2. Også slike invasive metoder indusere astrogliosis og øke AQP-4 immunoreactivity i parenchyma skadet hjernen og dens omgivelser11,12. Som astrocyttene og AQP-4 er viktige elementer av glymphatic, er CMc metoden for valg for sine studier. De viktigste fordelene ved CMc i forhold til mer invasiv prosedyrer er vedlikehold av en intakt skallen og hjernen parenchyma, unngå ICP endringer og astrogliosis, henholdsvis. Dermed åpner CMc sammen med ulike bildebehandlingsverktøy for en rekke muligheter til å studere ikke bare glymphatic systemet, men også dynamikken og mekanismer for strømning i homeostase og dyr modeller av nevrologiske sykdommer.
Den cisterna magna cannulation (CMc) prosedyren gir enkel og direkte tilgang til spinalvæske (CSF). Ved å injisere ulike molekyler (f.eks fluorescerende tracers, MRI kontrast agenter) kan eksperimentator spore deres bevegelser innen CSF rommet og vurdere aktiviteten til glymphatic systemet. Følgende protokollen beskriver både den akutte CMc, for injeksjoner umiddelbart etter kirurgi, og kronisk implantering av kanyle, der dyr gjenoppretter fra den kirurgiske prosedyren for en senere injeksjon. Den viktigste forskjellen mellom akutte og kroniske implantation er at kronisk implantation tillater for studier av glymphatic aktivitet i våken mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har presentert en protokoll som beskriver en detaljert fremgangsmåte for cisterna magna cannulation (CMc), som tilbyr en enkel metode for å levere merket molekyler CSF rommet. CMc kan den påfølgende visualiseringen av CSF dynamikk, både i vivo og ex vivo, bruker ulike modaliteter for imaging eller histology.
En av de viktigste fordelene med CMc teknikken ligger i den direkte tilgangen til subarachnoid rommet uten å utsette hjernen av craniotomy. Som ikke krever skall…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Novo Nordisk Foundation og National Institute av nevrologiske lidelser og slag, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. og S.H-R er mottakere av doc. og PhD stipend fra Lundbeck Foundation, henholdsvis.
Materials
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -. A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE–the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
