Аденоассоциированный вирус опосредованной трансген выражение в генетически определенных нейронов спинного мозга
Summary
Межпозвонковые инъекции рекомбиназа зависимых рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV) может использоваться для манипулирования любой тип генетически маркированных клеток спинного мозга. Здесь мы опишем, как передавать нейронов в спинной рога поясничного отдела спинного мозга. Эта техника позволяет функциональной допроса манипулировать нейрон подтипа.
Abstract
Селективный манипулирования позвоночника подгруппы нейронов был достигнут главным образом двумя различными способами: 1) совокупной генетики, whereby двойной или тройной трансгенных мышей создаются для того, чтобы достичь избирательным выражение репортер или эффекторных ген (например, от Rosa26 Локус) в желаемой позвоночника населения. 2) межпозвонковым инъекции Cre зависимых рекомбинантных аденоассоциированный вирус (rAAV); Здесь векторы AAV Cre зависимых кодирования для репортера или эффекторных гена выбора вводят в спинной мозг мышей, выражая рекомбиназа КРР в желаемой нейрональных субпопуляция. Этот протокол описывает способы создания Cre зависимых векторов rAAV и как передавать нейронов в спинной рога поясничного отдела спинного сегментах L3-L5 с rAAVs. Поясничного отдела позвоночника сегменты, L3-L5 иннервируются этих периферийных сенсорных нейронов, которые передают сенсорную информацию от гомотерия спонтанного поведения и ответы на сенсорные испытания применительно к задних конечностей, ипсилатеральные стороне инъекции могут быть проанализированы для того, чтобы допросить функцию манипулировать нейронов в сенсорной обработки. Мы предлагаем примеры как эта техника может использоваться для анализа генетически определена подгруппы нейронов спинного мозга. Основными преимуществами вирус опосредованной трансген выражения в Cre трансгенных мышей, по сравнению с классической репортер мыши индуцированной трансген выражения являются следующие: 1) различных Cre зависимой rAAVs кодирования различных репортер или эффекторных белков может быть вводят в одной Cre трансгенные линии, преодолев тем самым необходимость создания нескольких несколько трансгенные мыши линии. 2) межпозвонковым инъекции ограничивает манипуляции Cre выражая клеток в месте инъекции и на время после инъекции. Основными недостатками являются: 1) выражение гена репортера из rAAVs является более переменной. 2) хирургии требуется передавать позвоночника нейронов интерес. Какой из этих двух методов является более подходящим зависит от нейрона населения и исследований вопрос.
Introduction
Спинной мозг дорсальной имеет важное значение для обмена информацией между периферии тела и мозга. Сенсорные стимулы, такие как тепло, холод, сенсорных или вредных раздражителей распознаются специализированных периферийных нейронов, которые передают эту информацию нейронов спинного мозга Спинной рога. Здесь модулирует сложной сети тормозящее и возбуждающих интернейронов и в конечном итоге реле сенсорную информацию через нейроны спинного мозга проекции supraspinal сайты1,2. Вычисления, проведенного спинного Интер- и проекции нейронов строба сенсорной информации, таким образом определить какая информация подавлены или ретранслируется на какой интенсивности. Изменения в интеграции сензорных стимулах, например изменения баланса между торможения и возбуждения, может вызвать сенсорные дисфункции Гиперчувствительность или аллодиния (болевые ощущения после обычно болезненный стимуляции). Эти изменения являются считается основной причиной хронической боли в различных государств3,4. Таким образом, позвоночника цепи имеют первоочередное значение в сенсорной обработки и, следовательно, в восприятии окружающей среды организма и сам. С недавнего появления и сочетание молекулярных и генетических и хирургические методы, которые позволяют точного манипулирования генетически выявленных спинного мозга нейрон субпопуляций ученые сейчас начинают понимать основные позвоночника цепей ответственный за обработку различных сенсорных механизмов.
Межпозвонковым инъекции rAAV в мышах одичал тип или трансгенных внесла манипуляции, анализа и понимания функции конкретных подмножеств нейронов спинного мозга5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. Этот метод позволяет доставки маркера белков (например GFP / GFP синтез белков), репортер белков (например, GCaMP), или эффекторных белков (например, бактериальные токсины, channelrhodopsin или фармакогенетических рецепторов) в пространственно ограниченным образом нейронов спинного мозга. Местные инъекции Cre зависимой rAAVs в трансгенных мышей, выражая рекомбиназа КРР в определенное подмножество нейронов спинного мозга позволяет конкретный анализ соответствующих нейронов населения. Мы использовали этот метод для обозначения, удалять, подавляют или активировать спинного glycinergic нейронов, демонстрируя, что они являются неотъемлемой частью позвоночника ворота контроля боли и зуд передачи7. В этих экспериментах межпозвонковые инъекции Cre зависимой rAAV в GlyT2::Cre мышей позволили селективного манипуляции glycinergic нейронов в поясничного отдела спинного мозга. Таким образом можно избежать одновременной манипуляции supraspinal цепей, которые содержат glycinergic нейронов, решающее значение для выживания животного.
Хотя межпозвонковым инъекции rAAVs ограничивает инфекции на сайт инъекции, вирусный трансдукции может возникнуть не только в местных нейронов, но и в нейроны, которые подключаются к инъекции через аксональное прогнозы. Последние часто используется для трассировки ЦНС областях нейронов предоставления определенного ядра в головном мозге. Инфекция аксональное прогнозы однако, также может быть смешанным фактором при определенных населения нейронов должно учился в определенном сайте. Для решения этих вопросов, мы недавно провели всесторонний анализ AAV серотипов и выражение кассет для выявления серотипов и промоутеров, которые могут использоваться для сведения к минимуму или максимизировать Ретроградная трансдукции. В контексте конкретных исследований в позвоночнике цепей мы проанализировали способность различных серотипов и промоутеров передавать retrogradely нейронов в спинной корень ганглиев (DRG), Ростральные вентромедиального продолговатого мозга (RVM) и соматосенсорной коры 12. техника, изложенные в настоящем Протоколе, поэтому может использоваться для анализа позвоночника нейронов в месте инъекции или для анализа проекции нейронов, которые обеспечивают вклад вводят сайт спинного мозга. В протоколе, описанные здесь три инъекции rAAV в левой части поясничного отдела спинного выполняются для включения трансдукции нейронов в трех поясничных сегментов (L3-L5). L3-L5 сегментов получают большинство сенсорного ввода от задних конечностей ипсилатеральные в месте инъекции. Мы продемонстрировать, что функциональные манипуляции генетически помечены нейронов в L3-L5 достаточно, чтобы вызвать надежные поведенческие изменения, таким образом обеспечивая функциональные доказательств для цепи функции подтипом генетически помечены нейрона.
Protocol
Representative Results
Discussion
Межпозвонковые инъекции AAVs может стать мощной техникой в научно-исследовательской лаборатории, что позволяет анализ спинномозговой клеток с высоким временные и пространственные решения. Этот протокол позволяет трансдукции трех основных сегментов спинного мозга иннервируются сенсо…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Hanns Ulrich Zeilhofer за щедрую поддержку этой работы. Хендрик Wildner был поддержан Фондом Ольга Mayenfisch. Мы благодарим Кармен Бирхмайер за Lmx1b антител.
Materials
| Equipment | |||
| micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller | Zeitz | NA | |
| anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator | Weinmann | NA | |
| anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer | Midmark | NA | |
| Heat mat: Mio Star Thermocare 100 | Migros | 717614700000 | |
| Electric shaver | Philips | BT9290 | |
| surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | NA | |
| Small animal stereotaxic apparatus | Kopf | NA | |
| Neurostar StereoDrive (optional) | Neurostar | NA | |
| Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| PHD Ultra syringe pump with nanomite | Harvard Apparatus | 70-3601 | |
| Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 | Osada | OS-40 | |
| spherical cutter, 0.5mm | Busch | 12001005B | |
| electronic von Frey anesthesiometer | IITC | 23905 | |
| flexible von Frey hairs | IITC | #7 | |
| LSM710 Pascal confocal microscope | Zeiss | NA | |
| 0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective | Zeiss | NA | |
| 1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective | Zeiss | NA | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Tools | |||
| Scalpel Handle #4, 13cm | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Dumont #2 laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| Fine forceps #5 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Chemicals | |||
| Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter | World Precision Instruments | TW 100-3 | |
| Syringes (1, 5 and 20 ml) | B. Braun | (9166917V, 4606051V, 4606205V) | |
| 26G beveled needle | B. Braun | 4665457 | |
| Sterile scalpel blades | B. Braun | BB523 | |
| Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable | B. Braun | C1046220 | |
| Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable | B. Braun | C0932191 | |
| Sterile PBS or saline (0.9%) | NA | ||
| Ethanol, 70% (disinfectant) | NA | ||
| Iodine solution (e.g. Braunol) | B. Braun | 18380 | |
| Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) | Provet | 2222 | |
| Aldasorber | Provet | 333526 | |
| analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) | Indivior | GTIN: 7680419310018 | |
| Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) | Pharma medica | GTIN: 4031626710635 | |
| Cotton swabs (e.g. from) | IVF Hartmann | 1628100 | |
| Facial tissues (e.g. from) | Uehlinger AG | 2015.10018 | |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoScientific | J1800AMNZ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| C57BL/6J mice (wildtype) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:000664 | |
| Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) | The Jackson Laboratory | RRID:IMSR_JAX:023526 | |
| Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:007914 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral vectors | |||
| AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-PV1963 | |
| AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) | Penn Vector Core | AV-1-ALL854 | |
| AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato) | Penn Vector Core | AV-1-ALL864 | |
| AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) | Penn Vector Core | Custom production | |
| AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) | Penn Vector Core | Custom production | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | |
| pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP | Addgene | 20298 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacteria | |||
| MDS42 | ScarabGenomics | ||
| Stbl3 | ThermoScientific | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Quiagen | 12362 | |
| NucleoBond PC 500 | Machery & Nagel | 740574 | |
| clozapine-N-oxide (CNO) | Enzo Life Sciences | BBL-NS105-0025 | |
| chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| histamine | Sigma | H7125 | |
| Dapi | Invitrogen | D3571 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (dilution) | |||
| Rabbit anti-GFP (1:1000) | Molecular Probes | RRID:AB_221570 | |
| Rabbit anti-NeuN (1:3000) | Abcam | RRID:AB_10711153 | |
| Goat anti-Pax2 (1 : 200) | R & D Systems | RRID:AB_10889828 | |
| Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) | Dr Carmen Birchmeier | Muller et al. 2002 | |
| Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) | DakoCytomation | RRID:AB_10013382 | |
| Secondary antibodies raised in donkey (1:800) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | NA |
References
- Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
- Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
- Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
- Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
- Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413 (2016).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
- Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
- Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
- Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
- Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
- Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
- Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
- Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313 (2013).
- Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306 (2015).
- Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
- Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
- Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
- Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).
