الاستخدام العملي لتدخل الجيش الملكي النيبالي: التسليم الشفوي من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في ناقلات الحويصلية للصراصير
Summary
هذه المخطوطة يوضح استنفاد التعبير الجيني في الأمامي للصراصير الألمانية عن طريق الابتلاع عن طريق الفم من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في الدهنية.
Abstract
تدخل الجيش الملكي النيبالي ([رني]) وقد طبقت على نطاق واسع للكشف عن الوظائف البيولوجية للعديد من الجينات، وتوخيت كالآفات مراقبة أداة تعمل عن طريق تعطيل الجينات الأساسية. ورغم أساليب مختلفة، مثل حقن، التغذية، وامتصاص، للنجاح في إيصال الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (dsRNA)، الكفاءة [رني] من خلال التسليم الشفوي من دسرنا اختلافاً كبيرا بين مختلف مجموعات الحشرات. الصراصير الألمانية، جرمنيك Blattella، حساس بدرجة كبيرة إلى حقن دسرنا، كما أظهرت العديد من الدراسات التي سبق نشرها. ويصف هذه الدراسة وسيلة للبرهنة على أن دسرنا مغلفة مع الناقلين الحويصلية كافية تؤخر تدهور دسرنا عصير الأمامي. جدير بالذكر أن تغذية مستمرة من دسرنا المغلفة بواسطة الدهنية إلى حد كبير يقلل التعبير tubulin في الأمامي، وأدت إلى وفاة الصراصير. وفي الختام، لصياغة واستخدام ليبوبليكسيس دسرنا، التي تحمي دسرنا ضد نوكليسيس، يمكن أن يكون استخدام عملي من [رني] للسيطرة على الآفات الحشرية في المستقبل.
Introduction
قد ثبت [رني] كطريقة فعالة للتعبير الجيني ضربة قاضية من خلال إليه طريقا إسكات بوستترانسكريبشونال فجرها جزيئات دسرنا في كثير من حقيقيات النوى1. على مدى العقد الماضي للدراسة، وقد أصبح [رني] أداة مفيدة دراسة وظائف الجينات من التنمية إلى سلوك طريق المستنفدة للتعبير عن جينات محددة عن طريق الحقن و/أو تغذية دسرنا في الأنواع المختلفة من الحشرات2،3. نظراً لخصوصية ومتانة أثر مستنفدة، يجري حاليا النظر التطبيق [رني] كاستراتيجية محتملة لمكافحة الآفات مراقبة إدارة4،5. ومع ذلك، الكفاءة [رني] اختلافاً كبيرا بين أنواع الحشرات، اعتماداً على جينات مختلفة يجري استهداف وطرق التسليم. مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى أن عدم استقرار دسرنا، التي تتحلل ريبونوكليسيس، عامل حاسم في فعالية محدودة [رني]5،6. على سبيل المثال، أوضحت أن دسرنا مختلطة مع hemolymph المتدهورة بسرعة داخل مدار 17الحساسية [رني] منخفضة في سيكستا منداكا . وبالمثل، يرتبط بقوة وجود nucleases القلوية في الأمامي، التي تتحلل كفاءة دسرنا بلعها، مع انخفاض كفاءة [رني] في أوامر الحشرات المختلفة8،،من910.
تقديم شفوي دسرنا مثيرة للاهتمام لا سيما للتطبيق [رني] في استراتيجية لمكافحة الآفات، ولكن أسلوب تؤخر تدهور دسرنا التي نوكليسيس في الأمامي، لم توضع بعد، التي سيكون لديها القدرة على ضمان فعالية [رني] من خلال التغذية. ومع ذلك، أبلغت مشكلة عدم استجابة [رني] للتسليم الشفوي من دسرنا التغذية كمية كبيرة من دسرنا، مثلاً 50 ميكروغرام في بومباي موري، أو تغذية باستمرار لمدة 8 أيام (8 دسرنا ميكروغرام في المجموع) في الأنواع الجراد. الصراصير الألمانية، جيرمينيكا بلاتيلا، حساس بدرجة كبيرة إلى [رني] بحقن دسرنا11،12،،من1314، ولكن لا توجد استجابة إلى دسرنا من خلال التغذية. ومؤخرا، لين et al. (2017) أثبتت أن دسرنا تغليفها بنتائج الناقلين الحويصلية في [رني] ناجحة لضربة قاضية التعبير الجيني α-tubulin في وفيات كبيرة الأمامي والزناد الصراصير الألمانية15. كما تدهور دسرنا في الأمامي هو العامل المقيد للفم [رني]، الناقلين الحويصلية بمثابة وسيلة لحماية دسرنا من التدهور الذي سهولة المطبقة في الحشرات الأخرى مع أنشطة نوكلياسي قوية في الأمعاء. من المذكرة، والسبب في اختيار الكاشف تعداء خاصة (انظر الجدول للمواد) ونحن تستخدم الناقل الحويصلية في البروتوكول الحالي أنه قد تم اختباره للحشرات الخلية خط تعداء مع أقل سمية، استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة. ووفقا للمقارنة بين أنظمة تعداء الحويصلية مختلفة في غارافي et al. (2013) 16، كفاءة ترانسفيكتينج صغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA) هو تقريبا نفس بين هذه وغيرها من النظم المتاحة تجارياً التي استخدمت لمنظومات إيصال دسرنا في سائر الحشرات17،18 . وعلاوة على ذلك، لدينا أسلوب التغذية عناية كافية لضمان كمية مناسبة من دسرنا يتم تناولها بكل الصراصير، وأن النتائج قوية ومؤكدة. في ملخص، هذا البروتوكول والنتائج تثبت أن استخدام ليبوبليكسيس دسرنا يحسن الاستقرار دسرنا ويفتح الباب لتصميم استراتيجية تقديم شفوي [رني]، ونهج واعدة لمكافحة الآفات في المستقبل.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يقدم طريقة فعالة [رني] من خلال التسليم الشفوي من دسرنا ليبوبليكسيس، التي تشمل الحماية ضد الهضم ribonuclease في عصير الأمامي للصراصير الألمانية. كما هو مبين في الدراسات الأخرى في مختلف أنواع الحشرات، الأثر [رني] الفقراء من خلال التسليم الشفوي من دسرنا معظمهم ويعزى تدهور دسرنا<sup clas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من تايوان (وزارة العلوم والتكنولوجيا، وأكثر 100-2923-B-002-002-MY3 و 106-2313-B-002-011-MY3 إلى H.J.L.)، الجمهورية التشيكية (منح جامعة وكالة جنوب بوهيميا، جاجو منح 065/2017/ف Y.H.L)، وإسبانيا ( وزارة الاقتصاد الإسبانية، والقدرة التنافسية، والمنح المقدمة CGL2012 36251 و CGL2015-64727-ف X.B.، و “الحكومة الكاتالونية”، منح 2014 SGR 619 X.B.)؛ أيضا تلقي الدعم المالي من “الصندوق الأوروبي” “التنمية الإقليمية” (FEDER الأموال إلى X.B.) الاقتصادية.
Materials
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J., Jeon, K. W. Chapter Five – Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. 312, 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -. H., Belles, X., Lee, H. -. J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -. H., Lee, C. -. M., Huang, J. -. H., Lee, H. -. J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -. H., Huang, J. -. H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -. J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
