Utilisation pratique de l’interférence d’ARN : l’administration orale d’ARN Double brin dans Liposome transporteurs pour les blattes
Summary
Ce manuscrit montre l’épuisement d’expression de gène dans l’intestin moyen de la blatte germanique par ingestion orale de l’ARN double brin encapsulée dans des liposomes.
Abstract
L’interférence ARN (ARNi) a été largement appliqué pour découvrir les fonctions biologiques de nombreux gènes et il a été envisagé comme un outil de contrôle antiparasitaire marche par perturbation de l’expression des gènes essentiels. Bien que différentes méthodes, telles que l’injection, d’alimentation et de trempage, ont été signalés pour la mise en œuvre réussie de l’ARN double brin (dsRNA), l’efficacité de l’ARNi par administration orale de dsRNA est très variable entre les différents groupes d’insectes. La blatte germanique, Blattella germanica, est très sensible à l’injection d’ARNdb, comme en témoignent de nombreuses études publiées précédemment. La présente étude décrit une méthode pour démontrer que dsRNA encapsulé avec des transporteurs de liposome est suffisant pour retarder la dégradation de l’ARNdb par jus de l’intestin moyen. Notamment, l’alimentation continue des dsRNA encapsulé de liposomes significativement réduit l’expression de la tubuline dans l’intestin moyen et a causé la mort de cafards. En conclusion, la formulation et l’utilisation de lipoplexes dsRNA, qui protègent les ARNdb contre nucléases, pourraient être une utilisation pratique de l’ARNi pour le contrôle des insectes nuisibles à l’avenir.
Introduction
Arni a été démontrée comme une méthode efficace pour l’expression des gènes knockdown au moyen d’un mécanisme d’une voie de silencieux post-transcriptionnelle déclenchée par les molécules de dsRNA dans nombreux eucaryotes1. Ces dix dernières années d’étude, l’ARNi est devenu un outil utile pour étudier les fonctions des gènes du développement au comportement en appauvrissant l’expression de gènes spécifiques par injection et/ou alimentation d’ARNdb dans divers taxons d’insectes2,3. En raison de la spécificité et la robustesse de l’appauvrissant la couche d’effet, l’application de l’ARNi est actuellement considérée comme une stratégie potentielle de pest control management4,5. Cependant, l’efficacité de l’ARNi varie considérablement entre les espèces d’insectes, selon les différents gènes ciblés et les méthodes de livraison. Un corps croissant d’évidence suggère que l’instabilité des ARNdb, qui est dégradée par les ribonucléases, est un facteur critique dans l’efficacité limitée des Arni5,6. Par exemple, la faible sensibilité de l’ARNi dans Manduca sexta a été expliquée par le fait que l’ARNdb mélangé à l’hémolymphe était rapidement dégradé dans 1 heure7. De même, la présence des nucléases alcalines dans l’intestin moyen, qui efficacement dégrader dsRNA ingéré, est fortement corrélée à faible efficacité de RNAi dans des ordres différents insectes8,9,10.
L’administration orale de dsRNA est particulièrement intéressante pour l’application de l’ARNi dans une stratégie de lutte antiparasitaire, mais une méthode pour retarder la dégradation de l’ARNdb par les nucléases dans l’intestin n’a pas encore été développée, qui aurait le potentiel d’assurer efficacement ARNi en se nourrissant. Toutefois, le problème de blocage de l’ARNi pour administration orale de dsRNA a été signalé par la grande quantité de dsRNA, par exemple 50 µg du Bombyx mori, d’alimentation ou d’alimentation sans interruption pendant 8 jours (8 µg dsRNA au total) chez les espèces de criquets. La blatte germanique, Blatella germinica, est très sensible aux Arni par l’injection d’ARNdb11,12,13,14, mais ne répondre pas aux ARNdb en se nourrissant. Récemment, Lin et al. (2017) ont démontré que dsRNA encapsulés avec résultats porteurs liposome dans RNAi réussie à knockdown l’expression du gène α-tubuline dans l’intestin moyen et déclencher une mortalité significative de la blatte germanique15. Comme la dégradation des ARNdb dans l’intestin moyen est le facteur limitant pour RNAi orale, les transporteurs de liposome servent de véhicule pour protéger dsRNA de dégradation, qui est facilement applicable chez d’autres insectes avec activités nucléase forte dans le tube digestif. À noter, la raison d’avoir choisi le réactif de transfection particulière (voir Table des matières), nous avons utilisé comme transporteur de liposome dans le protocole actuel, c’est qu’il a été testé pour la transfection de cellules insectes ligne avec moins de toxicité, conformément à la instructions du fabricant. D’après la comparaison des systèmes de transfection différentes liposome Gharavi et al. (2013) 16, l’efficacité de transfection des petits ARN interférents (siARN) est approximativement la même entre ceci et d’autres systèmes disponibles dans le commerce qui ont été utilisés pour les systèmes de livraison de dsRNA dans autres insectes17,18 . De plus, notre méthode d’alimentation est assez prudent afin d’assurer une quantité suffisante de dsRNA est ingérée par chaque cafard, et que les résultats sont robustes et confirmés. En résumé, le présent protocole et les résultats démontrent qu’à l’aide de dsRNA lipoplexes améliore la stabilité de l’ARNdb et ouvre la voie à la conception de l’administration orale de stratégie de l’ARNi, qui est une approche prometteuse pour la lutte contre les ravageurs à l’avenir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole présente une méthode pour RNAi efficace par administration orale de dsRNA lipoplexes, impliquant la protection contre la digestion de la ribonucléase dans le jus de l’intestin moyen de la blatte germanique. Comme indiqué dans d’autres études dans diverses espèces d’insectes, l’effet de RNAi pauvre par administration orale de dsRNA est principalement expliquée par la dégradation de l’ARNdb8,9,10. Ce…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par des subventions de Taiwan (ministère de la Science et la technologie, plus 100-2923-B-002-002-MY3 et 106-2313-B-002-011-MY3 à H.J.L.), la République tchèque (subvention Agence de Bohême du sud Université, Gamal accorder 065/2017/P à Y.H.L) et (Espagne) Ministère espagnol de l’économie et la compétitivité, subventions CGL2012-36251 et CGL2015-64727-P X.B., et le gouvernement Catalan, accorder 2014 SGR / 619 à X.B.) ; Il a également reçu un soutien financier du Fonds européen pour le développement économique et régional (fonds FEDER à X.B.).
Materials
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
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