Praktisk bruk av RNA støy: muntlig levering av Double-strandet i Liposome stativer for Cockroaches
Summary
Dette manuskriptet viser uttømming av byggkorn under midttarmen og blir av den tysk kakerlakk gjennom muntlig svelging av double-strandet innkapslet i liposomer.
Abstract
RNA-interferens (RNAi) har vært mye brukt for avdekke biologiske funksjonene til mange gener, og har vært forutsett som en pest kontroll verktøyet drift ved avbrudd av viktige genuttrykk. Selv om ulike metoder, for eksempel injeksjon, fôring og soaking, er rapportert for vellykket levering av double-strandet RNA (dsRNA), er effektiviteten av RNAi gjennom muntlig levering av dsRNA svært variabel blant annet insekt-grupper. Den tyske affinitet Blattella germanicaer svært følsom for injeksjon av dsRNA, som vist av mange studier publisert tidligere. Studien beskriver en metode for å demonstrere at dsRNA innkapslet med liposome bærere er tilstrekkelig for å retard nedbrytning av dsRNA av midttarmen juice. Spesielt kontinuerlig fôring av dsRNA innkapslet av liposomer betydelig reduserer det tubulin uttrykket i midttarmen og blir, og førte til døden av cockroaches. Avslutningsvis kan formulering og utnyttelse av dsRNA lipoplexes, som beskytter dsRNA mot nucleases, være en praktisk bruk av RNAi til insekt skadedyrbekjempelse i fremtiden.
Introduction
RNAi har vist som en effektiv metode for å pusse genuttrykk gjennom en mekanisme av en post-transcriptional stanse sti utløst av dsRNA molekyler i mange eukaryoter1. Det siste tiåret av studien, har RNAi blitt et nyttig verktøy å studere funksjonene av gener fra utvikling til oppførsel av tappe uttrykk for bestemte gener via injeksjon og/eller fôring av dsRNA i ulike arter av insekter2,3. Spesifisitet og robusthet tappe effekt vurderes anvendelse av RNAi nå som potensielle strategi for pest kontroll management4,5. Men varierer effektiviteten av RNAi mellom insekt arter, avhengig av de ulike genene målrettet og leveringsmetodene. En voksende mengde bevis antyder at ustabilitet i dsRNA, som er nedverdiget ved ribonucleases, er en kritisk faktor i begrenset effekten av RNAi5,6. For eksempel har den lave RNAi følsomheten i Manduca sexta blitt forklart av det faktum at dsRNA blandet med hemolymph var raskt dårligere innen 1 time7. Tilsvarende er tilstedeværelsen av alkalisk nucleases i midttarmen og blir, som effektivt redusere inntatt dsRNA, sterkt korrelert med lav RNAi effektivitet i forskjellige insekt bestillinger8,9,10.
Muntlig levering av dsRNA er spesielt interessant anvendelse av RNAi i en pest kontroll strategi, men en metode for å retard nedbrytning av dsRNA av nucleases i midttarmen og blir ikke ennå har utviklet, som ville ha potensial til å sikre effektiv RNAi gjennom fôring. Imidlertid har fungere bedre av RNAi muntlig levering av dsRNA blitt rapportert av fôring store mengder dsRNA, f.eks 50 µg i Bombyx mori, eller kontinuerlig mating 8 dager (8 µg dsRNA totalt) locust arter. Den tyske affinitet Blattella germinica, er svært følsom for RNAi av injeksjon av dsRNA11,12,13,14, men svarer ikke til dsRNA gjennom fôring. Lin et al. nylig (2017) har vist at dsRNA innkapslet med liposome bærere gir vellykket RNAi til knockdown genuttrykk α-tubulin i midttarmen og utløse betydelig dødeligheten av tysk kakerlakk15. Som nedbrytning av dsRNA i midttarmen og blir den begrensende faktoren for muntlig RNAi, tjene liposome bærere som et redskap for å beskytte dsRNA fra fornedrelse, som er lett tilgjengelig i andre insekter med sterk nuclease aktiviteter i tarmen. Av notatet, grunnen til å velge bestemt hva reagensen (se Tabell for materiale) vi brukte liposome transportør i gjeldende protokollen er at det er testet for insekt cellen linje transfection med mindre toksisitet, ifølge den produsentens instruksjoner. I henhold til sammenligning av ulike liposome transfection systemer i Gharavi et al. (2013) 16, effektiviteten av transfecting lite forstyrrende RNA (siRNA) er omtrent det samme mellom denne og andre tilgjengelige systemer som har vært brukt i dsRNA leveringssystemer i andre insekter17,18 . Videre er våre fôring metoden forsiktig nok til å sikre riktig mengde dsRNA blir svelget av hver kakerlakk, og at resultatene er robust og bekreftet. Oppsummert viser stede protokollen og resultatene at bruker dsRNA lipoplexes forbedrer dsRNA stabilitet og åpner døren til design av strategi muntlig levering av RNAi, som er en lovende tilnærming til skadedyrbekjempelse i fremtiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol presents a method for effective RNAi through oral delivery of dsRNA lipoplexes, involving protection against ribonuclease digestion in the midgut juice of the German cockroach. Som vist i andre studier i ulike insekt arter, er dårlig RNAi effekten gjennom muntlig levering av dsRNA hovedsakelig regnskapsføres etter nedbrytning av dsRNA8,9,10. Denne protokollen gir liposomer tjene som beskyttende biler i muntlig le…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Taiwan (departementet for vitenskap og teknologi, mest 100-2923-B-002-002-MY3 og 106-2313-B-002-011-MY3 til H.J.L.), den tsjekkiske republikk (gi byrå av Sør-Böhmen University, GAJU gi 065 2017 inngående Y.H.L), og Spania ( Spanske departementet for økonomi og konkurranseevne, gir CGL2012-36251 og CGL2015-64727-P til X.B., og den katalanske regjeringen, gi 2014 SGR 619 til X.B.); Det har også mottatt økonomisk støtte fra europeiske fondet for økonomiske og regionaldepartementet (ble tildelt und midler til X.B.).
Materials
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J., Jeon, K. W. Chapter Five – Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. 312, 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -. H., Belles, X., Lee, H. -. J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -. H., Lee, C. -. M., Huang, J. -. H., Lee, H. -. J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -. H., Huang, J. -. H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -. J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
