Praktisk användning av RNA-interferens: muntliga leverans av dubbelsträngat RNA i Liposom bärare för kackerlackor
Summary
Detta manuskript visar utarmning av genuttryck i midgut av den tyska kackerlackan genom oralt intag av dubbelsträngat RNA inkapslade i liposomer.
Abstract
RNA-interferens (RNAi) har tillämpats allmänt för avtäckning de biologiska funktionerna av många gener och har planerats som en pest control verktyg drift av störningar av väsentliga genuttryck. Även om olika metoder, såsom injektion, utfodring och blötläggning, har rapporterats för framgångsrik leverans av dubbelsträngat RNA (dsRNA), är effektiviteten av RNAi genom muntliga leverans av dsRNA mycket varierande bland olika insekt grupper. Den tyska kackerlackan, Blattella germanica, är mycket känsliga för injektion av dsRNA, som visas av många studier publicerats tidigare. Föreliggande studie beskriver en metod för att påvisa att den dsRNA inkapslade med Liposom bärare är tillräcklig för att fördröja nedbrytningen av dsRNA genom midgut juice. Särskilt, kontinuerlig utfodring av dsRNA inkapslat av liposomer avsevärt minskar tubulin uttrycket i midgut, och ledde till döden av kackerlackor. Sammanfattningsvis, kan formulering och användning av dsRNA lipoplexes, som skyddar dsRNA mot nukleaser, vara en praktisk användning av RNAi för insekt skadedjursbekämpning i framtiden.
Introduction
RNAi har visats som en effektiv metod att knockdown genuttryck genom en mekanism av en post-transcriptional tysta vägen utlöses av dsRNA molekyler i många Eukaryoter1. Under det senaste decenniet av studien blivit RNAi ett användbart verktyg att studera funktionerna av gener från utveckling till uppförande av ozonnedbrytande uttrycket av specifika gener via injektion eller utfodring av dsRNA i olika taxa av insekter2,3. På grund av den specificitet och robusthet av nedbrytande effekten, är tillämpningen av RNAi för närvarande betraktas som en potentiell strategi för pest control management4,5. Dock varierar effektiviteten av RNAi mycket mellan insektsarter, beroende på de olika gener blir måltavla och leveransmetoder. En växande mängd bevis tyder på att instabiliteten i dsRNA, som bryts av ribonucleases, är en kritisk faktor i den begränsade effekten av RNAi5,6. Exempelvis har den låga RNAi-känsligheten i Manduca sexta förklarats av det faktum att den dsRNA blandat med hemolymph var snabbt försämrade inom 1 timme7. Likaså är förekomsten av alkaliska nukleaser i midgut, som effektivt försämra intas dsRNA, starkt korrelerad med låg RNAi effektivitet i olika insekters order8,9,10.
Den muntliga leveransen av dsRNA är särskilt intressant för tillämpningen av RNAi i en strategi för kontroll av skadedjur, men en metod för att fördröja nedbrytningen av dsRNA genom nukleaser i midgut har ännu inte utvecklats, som skulle ha potential att säkerställa en effektiv RNAi genom utfodring. Problemet inte svarar RNAi till muntliga leverans av dsRNA har dock rapporterats av utfodring stor mängd dsRNA, e.g. 50 µg i Bombyx mori, eller kontinuerligt utfodring för 8 dagar (8 µg dsRNA totalt) i locust arter. Den tyska kackerlackan, Blattella germinica, är mycket känslig för RNAi genom injektion av dsRNA11,12,13,14, men är inte mottaglig för dsRNA genom utfodring. Nyligen, Lin et al. (2017) har visat att dsRNA inkapslade med Liposom bärare resultat i framgångsrika RNAi till knockdown α-tubulin genuttrycket i midgut och utlösa betydande dödligheten hos den tyska kackerlacka15. Nedbrytningen av dsRNA i midgut är den begränsande faktorn för oral RNAi, fungera Liposom bärarna som ett fordon att skydda dsRNA från nedbrytning, som är lättillämpliga i andra insekter med stark nuclease aktiviteter i tarmen. Notera, anledningen till att välja särskilda transfection reagens (se Tabell för material) vi används som Liposom bärare i det nuvarande protokollet är att det har testats för insekt cell linje transfection med mindre toxicitet, enligt den tillverkarens instruktioner. Enligt jämförelsen av olika Liposom transfection system i Gharavi o.a. (2013) 16, effektiviteten i transfecting små störande RNA (siRNA) är ungefär lika mellan detta och andra kommersiellt tillgängliga system som har använts för dsRNA leverans system i andra insekter17,18 . Dessutom är vår utfodring metod försiktig nog att se till att rätt mängd dsRNA förtärs av varje kackerlacka, och att resultaten är robusta och bekräftade. Sammanfattningsvis visar den protokolls och resultaten att använda dsRNA lipoplexes förbättrar stabiliteten för dsRNA och öppnar dörren till utformningen av strategin muntliga leverans av RNAi, vilket är en lovande strategi för bekämpning av skadedjur i framtiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll presenterar en metod för effektiv RNAi genom muntliga leverans av dsRNA lipoplexes, som omfattar skydd mot ribonunkleas matsmältningen i midgut saften av den tyska kackerlackan. Som visas i andra studier i olika insektsarter, utgörs dålig RNAi effekten genom muntliga leverans av dsRNA mestadels av nedbrytningen av dsRNA8,9,10. Detta protokoll producerar liposomer som fungerar som skyddande fordon i muntliga l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från Taiwan (ministeriet för vetenskap och teknik, mest 100-2923-B-002-002-MY3 och 106-2313-B-002-011-MY3 till H.J.L.), Tjeckien (bevilja byrån i södra Böhmen universitet, Lennart bevilja Y.H.L 065/2017/P), och Spanien ( Spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft, beviljar CGL2012-36251 och CGL2015-64727-P X.B., och den katalanska regeringen, bevilja 2014 SGR 619 X.B.); Det har också fått ekonomiskt stöd från Europeiska fonden för ekonomisk och regionutveckling (ERUF-medel till X.B.).
Materials
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J., Jeon, K. W. Chapter Five – Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. 312, 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -. H., Belles, X., Lee, H. -. J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -. H., Lee, C. -. M., Huang, J. -. H., Lee, H. -. J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -. H., Huang, J. -. H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -. J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
