RNA müdahale pratik kullanımı: lipozom taşıyıcıları hamamböceği için çift iplikçikli RNA'ın sözlü teslim
Summary
Bu el yazması Almanca hamamböceği lipozomlar içinde kapsüllü çift iplikçikli RNA’ın sözlü sindirim yoluyla gen ifadesinin içinde midgut tükenmesi gösterir.
Abstract
RNA müdahale (RNAi) biyolojik fonksiyonları çok sayıda gen açığa çıkarmak için yaygın olarak uygulanan ve bir haşere kontrol aracı temel gen ekspresyonu bozulma tarafından işletim olarak öngörülen. Besleme ve iliklerine kadar enjeksiyon gibi farklı yöntemler çift iplikçikli RNA (dsRNA) başarılı teslimi için bildirilmiş olan, RNAi verimliliği oral dsRNA teslimini aracılığıyla farklı böcek grupları arasında son derece değişken olsa da. Alman Hamam böceği, Blattella germanica, birçok çalışma daha önce Yayınlanan tarafından gösterildiği gibi dsRNA, enjeksiyon için son derece hassas olur. Bu da çalışmanın lipozom gemileri ile kapsüllü dsRNA dsRNA bozulma midgut suyu tarafından geri zekalı için yeterli olduğunu ispat yöntemi açıklanır. Özellikle önemli ölçüde lipozomlar tarafından kapsüllü dsRNA sürekli besleme midgut tübülin ifadede azaltır ve hamamböceği ölümüne yol açtı. Sonuç olarak, formülasyonu ve dsRNA enzimler karşı korumak, dsRNA lipoplexes kullanımı pratik kullanımı RNAi Böcek ilaçlama için gelecekte olabilir.
Introduction
RNAi döngüsünün birçok Ökaryotlar1dsRNA moleküller tarafından tetiklenen bir çoğu silencing bir mekanizma aracılığıyla devirme gen ekspresyonu için etkili bir yöntem olarak kanıtlanmıştır. Çalışmanın son on yıldır, RNAi enjeksiyon yoluyla belirli genlerin ifade tüketen ve/veya çeşitli takson böcekler2,3dsRNA, besleme için davranış geliştirme genlerin fonksiyonları eğitim için yararlı bir araç haline gelmiştir. Özgüllük ve sağlamlık tüketen etkisi nedeniyle, uygulama, RNAi şu anda haşere kontrol yönetimi4,5için potansiyel bir strateji olarak kabul ediliyor. Ancak, RNAi verimliliğini yaygın hedef farklı genler ve teslim yöntemleri bağlı olarak böcek türler arasında değişir. Kanıt büyüyen bir vücut dsRNA, ribonükleaz tarafından bozulmuş, istikrarsızlık RNAi5,6sınırlı etkinliği kritik bir faktör olduğunu göstermektedir. Örneğin, Manduca sexta düşük RNAi duyarlılık hemolymph ile karışık dsRNA 1 saat7içinde hızlı bir şekilde bozulmuş gerçeği açıkladı. Benzer şekilde, verimli bir şekilde alınan dsRNA düşürebilir, alkalin enzimler içinde midgut varlığı kuvvetle farklı böcek sipariş8,9,10düşük RNAi verimlilik ile ilişkilidir.
DsRNA oral teslimat RNAi uygulamada bir haşere kontrol stratejisi için özellikle ilginç, ancak midgut enzimler tarafından dsRNA bozulma geri zekalı bir yöntem henüz, hangi etkili sağlamak için potansiyel var geliştirilmiştir değil RNAi besleme yoluyla. Ancak, RNAi yanıt alamama durumu dsRNA oral teslimat için dsRNA, örneğin 50 µg Bombiks moriiçinde büyük miktarda besleme veya 8 gün (Toplam 8 µg dsRNA) keçiboynuzu türler için sürekli besleme tarafından bildirilmiştir. Alman Hamam böceği, Blattella germinica, RNAi için son derece hassas dsRNA11,12,13,14enjeksiyonu ile ama besleme yoluyla dsRNA yanıt vermiyor. Son zamanlarda, Lin vd. (2017) dsRNA nakavt için başarılı RNAi lipozom taşıyıcıları sonuçlarında ile α-tübülin gen ekspresyonu midgut ve tetikleyici önemli mortalite Alman Hamam böceği15kapsüllenmiş olduğunu göstermiştir. DsRNA midgut içinde bozulma sözlü RNAi için sınırlayıcı bir faktör olduğu gibi lipozom taşıyıcıları bozulması, kolayca diğer böcekler gut güçlü nükleaz faaliyetleri ile ilgili olan dsRNA korumak için bir araç olarak hizmet vermektedir. Dikkat, belirli transfection reaktif seçtiğiniz için nedeni, lipozom gemisi geçerli protokol bu böcek hücre satırı transfection için daha az toksisite ile test edilmiş olduğu gibi biz kullanılan ( Tablo malzemelerigörmek) göre prosedürü yerine getirin. Gharavi ve ark. farklı lipozom transfection sistemlerinde karşılaştırma göre (2013) 16, transfecting küçük müdahale RNA (siRNA) verimliliğini yaklaşık bu ve diğer böcekler17,18 dsRNA dağıtım sistemleri için kullanılan piyasada bulunan diğer sistemleri arasında aynıdır . Ayrıca, bizim besleme yöntemi dsRNA uygun miktarda her hamamböceği tarafından yutulur ve sonuçları sağlam ve onaylanan emin olmak dikkatli olduğunu. Özet olarak, dsRNA lipoplexes kullanarak dsRNA istikrar geliştirir ve gelecekte haşere kontrolü için umut verici bir yaklaşım olduğu tasarım RNAi, strateji oral teslimat için kapıyı açar mevcut iletişim kuralı ve sonuçları göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı için dsRNA lipoplexes, sözlü teslim yoluyla etkili RNAi Alman Hamam böceği midgut suyu ribonükleaz sindirim karşı koruma içeren bir yöntem sunuyor. Böcek türleri diğer çalışmalarda gösterildiği gibi zavallı RNAi etkisi dsRNA sözlü teslim yoluyla çoğunlukla için dsRNA8,9,10bozulması tarafından muhasebeleştirilir. Bu iletişim kuralı oral teslimat dsRNA gut düşmesine karşı koruy…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada (Bakanlığı bilim ve teknoloji, en 100-2923-B-002-002-MY3 ve H.J.L. 106-2313-B-002-011-MY3), Tayvan gelen hibe tarafından desteklenmiştir Çek Cumhuriyeti (Grant ajansı South Bohemia Üniversitesi, GAJU vermek 065/2017/P Y.H.L için) ve İspanya ( X.B. ve Katalan hükümet İspanyolca Ekonomi Bakanlığı ve rekabet gücünü, CGL2012-36251 ve CGL2015-64727-P verir 2014 SGR 619 X.B. için vermek); Bu aynı zamanda ekonomik ve bölgesel kalkınma (FEDER fon X.B. için) için Avrupa fonundan mali destek aldı.
Materials
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J., Jeon, K. W. Chapter Five – Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. 312, 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -. H., Belles, X., Lee, H. -. J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -. H., Lee, C. -. M., Huang, J. -. H., Lee, H. -. J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -. H., Huang, J. -. H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -. J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
