Uso prático da interferência do RNA: Oral entrega de RNA Double-stranded em lipossomas transportadoras para baratas
Summary
Este manuscrito demonstra o esgotamento de expressão gênica no intestino da barata alemão através da ingestão oral de RNA double-stranded encapsulada em lipossomas.
Abstract
RNA de interferência (RNAi) tem sido aplicado extensamente para descobrir as funções biológicas de numerosos genes e foi previsto como uma praga controle ferramenta de exploração por perturbação da expressão do gene essencial. Embora diferentes métodos, tais como a injeção, alimentação e imersão, têm sido relatados para entrega bem sucedida de RNA double-stranded (dsRNA), a eficiência de RNAi através de entrega oral do dsRNA é altamente variável entre os diferentes grupos de insetos. A baratinha, Blattella germanica, é altamente sensível à injecção de dsRNA, como mostrado por muitos estudos publicados anteriormente. O presente estudo descreve um método para demonstrar que o dsRNA encapsulado com transportadoras em lipossomas é suficiente para retardar a degradação do dsRNA por suco de intestino. Notavelmente, a alimentação contínua do dsRNA encapsulado por lipossomas significativamente reduz a expressão de tubulina no intestino e levou à morte de baratas. Em conclusão, a formulação e utilização dos lipoplexes dsRNA, que protegem o dsRNA contra nucleases, poderiam ser um uso prático de RNAi para controle de pragas de insetos no futuro.
Introduction
RNAi tem sido demonstrado como um método eficaz para a expressão do gene “knockdown” através de um mecanismo de uma via de silenciamento pós-transcricional desencadeada por moléculas de dsRNA em muitos eucariotos1. Durante a última década de estudo, RNAi tornou-se uma ferramenta útil para estudar as funções dos genes de desenvolvimento para o comportamento por esgotar a expressão de genes específicos, através da injeção e/ou alimentação do dsRNA em vários táxons de insetos2,3. Devido a especificidade e a robustez do efeito de esgotamento, a aplicação de RNAi atualmente está sendo considerada como uma estratégia potencial para controle de pragas de gestão4,5. No entanto, a eficiência de RNAi varia amplamente entre as espécies de insetos, consoante os diferentes genes alvo e os métodos de entrega. Um corpo crescente de evidências sugere que a instabilidade do dsRNA, que é degradada por ribonucleases, é um fator crítico na eficácia limitada de RNAi5,6. Por exemplo, a baixa sensibilidade de RNAi em Manduca sexta foi explicada pelo fato de que o dsRNA misturado com hemolinfa foi rapidamente degradado dentro de 1 hora,7. Da mesma forma, a presença de nucleases alcalinas no intestino, que eficientemente degradar dsRNA ingerido, é fortemente correlacionada com baixa eficiência de RNAi em diferentes ordens de insetos8,9,10.
A entrega oral de dsRNA é particularmente interessante para a aplicação de RNAi em uma estratégia de controle de pragas, mas um método para retardar a degradação do dsRNA pelas nucleases no intestino ainda não foi desenvolvido, que teria potencial para assegurar a eficaz RNAi através da alimentação. No entanto, a apatia de RNAi para entrega oral do dsRNA foi relatada por alimentação grande quantidade de dsRNA, por exemplo, 50 µ g/ml Bombyx mori, ou continuamente alimentando por 8 dias (8 µ g dsRNA no total) das espécies de gafanhoto. A baratinha, Blattella germinica, é altamente sensível a RNAi através da injeção de dsRNA11,12,13,14, mas não é responsiva ao dsRNA através da alimentação. Recentemente, Lin et al. (2017) demonstraram que o dsRNA encapsulados com resultados de transportadoras em lipossomas em RNAi bem sucedida a nocaute a expressão do gene α-tubulina no intestino e gatilho mortalidade significativa da baratinha15. Como a degradação do dsRNA no intestino é o fator limitante para RNAi oral, os portadores de lipossoma servem como um veículo para proteger dsRNA de degradação, que é facilmente aplicável em outros insetos com atividades de nuclease forte no intestino. Digno de nota, o motivo para a escolha do reagente de transfeccao particular (ver Tabela de materiais) usamos como portador de lipossomas no atual protocolo é que ele foi testado para transfeccao de linha celular inseto com menor toxicidade, de acordo com o instruções do fabricante. De acordo com a comparação dos sistemas de transfeccao lipossoma diferentes no guerreiro et al (2013) 16, a eficiência do transfecting RNA de interferência pequeno (siRNA) é aproximadamente o mesmo entre este e a outros sistemas disponíveis comercialmente que têm sido utilizados para sistemas de entrega dsRNA em outros insetos17,18 . Além disso, nosso método de alimentação é cuidadoso o suficiente para garantir a quantidade adequada de dsRNA é ingerida por cada barata, e que os resultados são robustos e confirmado. Em resumo, o presente protocolo e os resultados demonstram que usar dsRNA lipoplexes melhora a estabilidade do dsRNA e abre as portas para o design da entrega oral estratégia de RNAi, que é uma abordagem promissora para controle de pragas no futuro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo apresenta um método para RNAi eficaz através de entrega oral dos lipoplexes dsRNA, envolvendo proteção contra digestão ribonuclease no suco de intestino da barata alemão. Como mostrado em outros estudos em várias espécies de insetos, o efeito de RNAi pobre através de entrega oral do dsRNA principalmente é contabilizado pela degradação de dsRNA8,9,10. Este protocolo produz lipossomas que servem como pro…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado por doações de Taiwan (Ministério da ciência e tecnologia, mais 100-2923-B-002-002-MY3 e 106-2313-B-002-011-MY3 para H.J.L.), República Checa (conceder a agência da Boémia do Sul, Universidade, Magali conceder 065/2017/P para Y.H.L) e Espanha ( Ministério da economia espanhola e competitividade, concede CGL2012-36251 e CGL2015-64727-P a X.B. e o governo catalão, conceder 2014 SGR 619 a X.B.); também recebeu apoio financeiro do Fundo Europeu para o desenvolvimento económico e Regional (fundos FEDER para X.B.).
Materials
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
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