Imagerie de cellules vivantes de la ségrégation des chromosomes pendant la mitose

Résumé

Ce protocole décrit une méthode simple et pratique pour étiqueter et visualiser direct chromosomes dans les cellules mitotiques en utilisant l’étiquette Histone2B-GFP BacMam 2.0 et un système de microscopie confocale tourne disque.

Résumé

Chromosomes doivent être fiable et uniforme divisés en cellules filles pendant la division cellulaire mitotique. Fidélité de la ségrégation chromosomique est contrôlée par les mécanismes multiples qui incluent le Checkpoint de montage broche (SAC). Le SAC fait partie d’un système de rétroaction complexe qui est responsable de la prévention d’un progrès de cellulaire par mitose, à moins que tous les kinétochores chromosomiques ont joint à la broche de microtubules. Calorifugeage chromosomique et chromosome anormal est un indicateur des postes de contrôle dysfonctionnel cycle cellulaire de la ségrégation et peut être utilisée pour mesurer la stabilité génomique des cellules en division. Déréglementation du SAC peut entraîner la transformation d’une cellule normale en une cellule maligne à travers l’accumulation des erreurs au cours de la ségrégation chromosomique. Mise en œuvre du SAC et la formation du kinétochore complexe sont étroitement contrôlée par les interactions entre les kinases et phosphatases tels que de la protéine Phosphatase 2 a (PP2A). Ce protocole décrit l’imagerie de cellules vivantes des chromosomes dans les fibroblastes embryonnaires de souris isolés de souris qui avaient un masquage de la sous-unité régulatrice PP2A-B56γ à la traîne. Cette méthode permet de surmonter les défauts des autres cell cycle control techniques d’imagerie comme cytométrie ou immunocytochimie seulement présentent un portrait de cellulaire cytocinèse, au lieu d’une visualisation dynamique spatio-temporelle des chromosomes au cours de la mitose.

Introduction

Dans le protocole suivant, nous décrivons une méthode pratique pour visualiser la ségrégation chromosomique et la progression mitotique au cours du cycle cellulaire dans les fibroblastes embryonnaires de souris à l’aide d’Histone 2 b-GFP, marquage BacMam 2.0 et l’imagerie de cellules vivantes.

Points de contrôle de cycle cellulaire surveillent la ségrégation des chromosomes et jouent un rôle important dans le maintien de l’intégrité génétique de la cellule ^1,2,3. Accumulation de mauvaise ségrégation chromosomes peut conduire à aneuploïdie, qui est ....

Protocole

Toutes les expériences menées dans ces études ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de l’emploi et d’institutionnels animalier dans le centre de recherche de Food and Drug Administration (FDA).

1. isolement et Culture de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs)

1. Isoler les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) d’une souche de PP2A-B56γ-souris et ceux de type sauvage par le protocole standard ^7,8,9.
2. ExpandMEFs pour 3 passages, congeler et stocker jusqu'à ce que nécessaire pour expériences ....

Résultats

MEFs de type sauvage et PP2A-B56γ-souris ont été ensemencées dans une chambre de 2 puits couvercle en verre et autorisés à fixer. Jour 2, MEFs ont été synchronisées à l’aide de 0,1 % FBS pendant 24 h. Jour 3, MEFs dans les médias, avec 200 ng/mL nocodazole et 30 CL de PPC-HB regentwere incubés pendant 18 h à 37^{° C et 5 % CO}₂. Jour 4, les cellules ont été projetés en utilisant un système de microscope confocal de disque de rotation (Figure 1

Discussion

Points de contrôle de contrôle cycle cellulaire qui assurent la ségrégation des chromosomes précis empêchent aneuploïdie et cell transformation ^1,2,3. Dans la présente étude, nous avons trouvé que l’inactivation de PP2A-B56γ a donné lieu à un poste de contrôle de l’Assemblée broche affaibli. L’imagerie de cellules vivantes nous a permis d’observer la mis-ségrégation chromosomique au cours de la mitose chez MEFs PP2A-B56γ traités.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM/F12	Gibco	11320082
L-Glutamine	Gibco	25030081
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100X)	Gibco	11140050
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco	15140122
Dulbecco' s Phosphate Saline tamponnée	Gibco	14190144
Trypsine-EDTA	Gibco	25300054
Sérum fœtal bovin	Atlanta Biologicals	S11150
DMSO	EMD Millipore	MX 1458-6
Boîtes de conservation de flacons cryogéniques	Fisherbrand	10-500-28
Flacons cryogéniques	Corning/costar	431416
Fioles T75	Cellstar	658175
2 verre de couverture bien chambré	Nunc	155380PK
Cellomètre Vision Cell Profiler	Nexcelom Bioscience LLC	Cellomètre Vision Trio
Nocodazole	Sigma	M1404
CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher Scientific Inc.	C10594
Zeiss Cell Observer Système de microscope confocal à disque rotatif	Microscopie Carl Zeiss Zeiss	Cell Observer SD
Bain-marie	Thermoscientific	série
Incubateur	Sanyo solutions commerciales	MCO-18AIC (UV)
Classe II Armoire de sécurité biologique	The Baker Company	SterilGard
Logiciel Axiovision	Zeiss	Ver.4.8.2
Logiciel ImageJ	national de la santé	Ver. 1.51r

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