Levende celle Imaging av kromosom segregering under mitose
Summary
Denne protokollen beskriver en enkel og praktisk metode for å merke og visualisere live chromosomes mitotisk celler ved hjelp av Histone2B-GFP BacMam 2.0 etiketten og en roterende plate AC confocal mikroskopi system.
Abstract
Kromosomene må være pålitelig og jevnt segregert i datter celler under mitotisk celledeling. Gjengivelse av chromosomal segregering styres av flere mekanismer som inkluderer spindelen montering Checkpoint (SAC). SAC er del av en kompleks feedback-systemet som er ansvarlig for forebygging av en celle fremgang gjennom mitose med mindre alle chromosomal kinetochores har lagt for å vri piskehale som henger. Chromosomal henger og unormale kromosom raseskille er en indikator på dysfunksjonelle celle syklus kontroll sjekkpunkter og kan brukes til å måle genomisk stabiliteten på deler celler. Dereguleringen av SAC kan føre transformasjonen av en normal celle i en ondartet celle gjennom akkumulering av feil under chromosomal raseskille. Gjennomføringen av SAC og dannelsen av kinetochore kompleks er strengt regulert av interaksjoner mellom kinaser og fosfatase som Protein fosfatase 2A (PP2A). Denne protokollen beskriver levende celle avbilding av henger chromosomes mus embryonale fibroblaster isolert fra mus som hadde en knockout av PP2A-B56γ regulatoriske delenhet. Denne metoden overvinner svakhetene ved andre cellen syklus kontroll Bildeteknikker som flowcytometri eller immunocytochemistry som bare gir et øyeblikksbilde av celle cytokinesis status i stedet for en dynamisk spatiotemporal visualisering av kromosomer under mitose.
Introduction
I den følgende protokollen beskriver vi en praktisk metode for å visualisere chromosomal segregering og mitotisk progresjon i cellen syklus i mus embryonale fibroblaster Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 merking og levende celle bildebehandling.
Cellen syklus kontroll sjekkpunkter overvåke kromosom segregering og spiller en viktig rolle i vedlikehold av genetisk integriteten til den celle 1,2,3. Akkumulering av mis segregerte kromosomer kan føre til aneuploidy, som er et kjennetegn på mest solide svulster 4. Påvisning av henger kromosomene kan derfor brukes som en metode for å studere chromosomal ustabilitet.
Fluorescently merket proteiner kan brukes å visualisere live kromosom segregering og chromosomal henger men generering av mCherry-merket eller H2B-GFP merket protein krever betydelig kunnskap om gen levering og molekylærbiologi 5. Her beskriver vi bruk av CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0 reagens, heretter kalt CL-HB regent, for enkelhets skyld. Denne reagensen kan brukes umiddelbart og således eliminerer bekymringer om vektor kvalitet og integritet. I tillegg krever denne reagensen ikke bruk av potensielt skadelige behandlinger eller lipider og fargestoff lasting kjemikalier. I motsetning til konvensjonelle fluorescerende etiketter, CL-HB regent flekker uavhengig funksjon (dvs., membran potensial). CL-HB regent kan bare legges til cellene og ruges overnatting i protein uttrykk. CL-HB regent replikerer ikke i pattedyrceller og kan brukes i biosikkerhet (BSL) 1 laboratorium innstillinger. Også kan denne forbigående transfection bli oppdaget etter overnatting inkubasjonstiden for opp til 5 dager, nok tid til å utføre mest dynamiske mobilnettet analyser.
Alternativt kunne kromosomavvik bli studert av ulike teknikker som flowcytometri, immunohistochemistry eller fluorescens i situ hybridisering (fisk) 6. Flowcytometri kan brukes til å studere aneuploidy, som kan måles basert på DNA innhold og fasen av celler i cellen syklus. Selv om flowcytometri kan brukes til å måle aneuploidy, gir det ikke informasjon på chromosomal mis raseskille. FISK og immunohistochemistry bruke fluorescerende sonder binde til DNA eller kromosomer. Disse teknikkene gir et øyeblikksbilde av statusen for en populasjon av celler, tillater de ikke levende celle imaging dermed mangler informasjon innhentet gjennom spatiotemporal visualisering av cytokinesis i bestemte celler fulgte over en tidsperiode.
Denne protokollen ble brukt til å studere henger kromosomer eller chromosomal mis segregering i nocodazole behandlet mus embryonale fibroblaster (MEFs) isolert fra PP2A-B56γ-mus. I tillegg til program over gir denne protokollen et enkelt verktøy for å merke og visualisere chromosomal segregering i ulike celletyper som kan brukes til å studere celle syklus regulering eller chromosomal ustabilitet i kreftceller. Dessuten, kan det også brukes til å studere chromosomal instability forårsaket av ulike medikamentelle behandlinger eller studere virkningene av genet banke ut resultere i chromosomal mis raseskille.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellen syklus kontroll sjekkpunkter som sikrer nøyaktig kromosom segregering hindre aneuploidy og celle transformasjon 1,2,3. I studien, fant vi at inaktivering av PP2A-B56γ resulterte i en redusert spindelen montering checkpoint. Levende celle imaging tillatt oss å observere chromosomal mis segregering under mitose i PP2A-B56γ MEFs behandlet med nocodazole 9.
Denne protoko…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Dr. Guo-Chiuan Hung og Dr. Bharatkumar Joshi for verdifulle kommentarer som forbedret manuskriptet.
Materials
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
References
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing. Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22, 966-980 (2012).
- Jallepalli, P. V., Lengauer, C. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).
- Zhu, L., et al. Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis. J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).
- Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. The detection and implication of genome instability in cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).
- Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development. Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (64), e3854 (2012).
- Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint. Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).
- Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites. Sci Rep. 8 (4), 7362 (2014).
- Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity. Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).
- Iuso, D., et al. Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures. Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).
- Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies. Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).
