Double-Stranded RNA Oral Liefermethoden induzieren RNA-Interferenz im Phloem und Pflanze-Sap-Fütterung Hemipteran Insekten

Summary

Dieser Artikel beschreibt neuartige Techniken für mündliche Lieferung doppelsträngige RNA (DsRNA) durch die Leitbündel Gewebe von Pflanzen für die RNA-Interferenz (RNAi) im Phloem Sap Futterinsekten entwickelt.

Abstract

Phloem und Pflanze SAP-Fütterung Insekten dringen in die Integrität von Pflanzen und Früchten zum Abrufen von Nährstoffen in den Prozess Nahrungspflanzen zu beschädigen. Hemipteran Insekten entfallen eine Reihe von wirtschaftlich erhebliche Schädlinge der Pflanzen, die Schäden an Kulturpflanzen durch die Fütterung auf Phloem Sap. Braun Marmorated Gestank Fehler (BMSB), Halyomorpha Halys (Heteroptera: Pentatomidae) und asiatische Zitrus Psyllid (ACP), Diaphorina Citri Teru (Hemiptera: Liviidae) sind hemipteran Schädlinge eingeführt in Nordamerika, wo sie sind Sie eine invasive landwirtschaftlichen Schädlingsbekämpfung hochwertige Spezialität, Zeile, und Nutzpflanzen und Zitrusfrüchte sowie ein Ärgernis-Schädling, wenn sie drinnen aggregieren. Insektizid-Widerstand in vielen Arten führte zu die Entwicklung von alternativen Methoden der Schädlingsbekämpfung-Management-Strategien. Doppelsträngige RNA (DsRNA)-vermittelten RNA-Interferenz (RNAi) ist ein Gen-silencing-Mechanismus für funktionelle Genomforschung Studien, die potenzielle Anwendungen als Werkzeug für das Management von Schadinsekten. Exogen synthetisiert DsRNA oder kleine interferierende RNA (SiRNA) auslösen kann, hocheffiziente gen-silencing durch den Abbau der endogene RNA, die Homolog zu, die vorgestellt wird. Effektive und ökologische Nutzung der RNAi als molekulare Biopestizide für Biocontrol hemipteran Insekten erfordert die in Vivo -Lieferung von DsRNAs durch die Fütterung. Hier zeigen wir Methoden für die Lieferung von DsRNA an Insekten: Laden von DsRNA in grünen Bohnen durch Untertauchen und Absorption von Gen-spezifischen DsRNA mit mündlichen Lieferung durch Verschlucken. Wir haben auch nicht-transgenen Pflanze Lieferung Ansätzen Blatt-Sprays, Wurzel durchnässen, Stamm Injektionen sowie tongranulat, die möglicherweise wichtig für anhaltende Freisetzung von DsRNA skizziert. Effiziente Bereitstellung von oral eingenommenen DsRNA wurde als eine effektive Dosierung induzieren eine signifikante Abnahme der Ausdruck gezielt Gene, wie Juvenilhormon Säure O-Methyltransferase (JHAMT) und Vitellogenin (Vg) bestätigt. Diese innovativen Verfahren stellen Strategien für die Lieferung von DsRNA im Pflanzenschutz und Umwelt meistern zur Schädlingsbekämpfung.

Introduction

Hemipteran Insekten umfassen einige der wirtschaftlich bedeutenden Schädlinge von Agriculturebecause Kräften zu erreichen hohe Bevölkerungswachstum und Krankheiten bei Pflanzen zu verbreiten. BMSB, H. Halys Stål, ist eine invasive Schädling, der versehentlich mit der ersten Sichtung in 1996¹berichtet in der westlichen Hemisphäre in Allentown, Pennsylvania aus Asien (China, Taiwan, Korea und Japan) eingeführt wurde. Seit seiner Einführung BMSB wurde in 43 Staaten mit den höchsten Bevölkerungen in der Mid-Atlantic (DE, MD, PA, NJ, VA, und WV) sowie in Kanada und Europa, erkannt und stellt eine potenzielle Bedrohung für die Landwirtschaft². Als polyphag Schädling kann BMSB Schäden an rund 300 identifizierten Pflanze Gastgeber unter anderem hochwertige Kulturen wie Äpfel, Trauben, Zierpflanzen, Feldbestände, Sojabohnen und Mais einzuleiten. Schaden ist in erster Linie durch die Art der Fütterung, bekannt als Worte und bündig, wo das Tier durchdringt die Gastgeber-Ernte mit seinen nadelartigen Mandrin zu den Nährstoffen aus der Vascular Gewebe^2,3zugreifen. BMSB ist auch einen indoor-Schädling wie sie Wohnsitz in Wohnbereichen wie Schulen finden können und im Herbst bis Winter²Häuser. Chemikalien und aeroallergene von BMSB veröffentlicht wurden illegale allergische Reaktion bei Frucht Ernte Arbeiter gemeldet. BMSB kann auch zu allergischen Erkrankung führt zu Kontaktdermatitis, Konjunktivitis und Rhinitis bei empfindlichen Personen^4,5beitragen. Ein anderes hemipteran Insekt, ACP, D. Citri Teru (Hemiptera: Liviidae) ist eine schwere Pest von Zitrusfrüchten und überträgt die Phloem-limitierte Bakterien (Verbindung Liberibacter Asiaticus) Huanglongbing (HLB), besser bekannt als citrus Greening Krankheit^6,7. HLB wurde erstmals berichtet, aus dem südlichen China und auf 40-verschiedener asiatischer, afrikanischer, ozeanischer, Süd- und nordamerikanischen Länder⁷ausgebreitet hat. Citrus Greening ist ein weltweites Problem mit bedrohlichen wirtschaftlichen und finanziellen Verluste durch den Verlust von Zitrusfrüchten; Management von ACP gilt daher von größter Bedeutung für die Vorbeugung und Bekämpfung von HLB.

Maßnahmen für eine effektive Kontrolle von diesen Schadinsekten erfordert in der Regel, dass die Anwendung von chemischen Pestiziden, die relativ kurz gelebt. Chemischen Insektiziden Kontrollstrategien oft fehlen sichere Umwelt-Management-Strategien oder Anfälligkeit durch Pestizid Widerstand in Pest Populationen^8,9abgenommen haben. Daher die biologische Bekämpfung von Schädlingen mit molekularen Biopestizide ist eine mögliche Alternative, aber seine Verwendung weltweit bleibt bescheiden und verschiedene Arten von Parasitoide (z. B. Trisolcus Japonicus) können auch als natürliche biologische wirksam sein Kontrollen. RNAi ist eine neue Technologie für die Verwaltung von invasiver Schadinsekten mit molekularen Biopestizide¹⁰Potenzial. RNAi ist gut beschrieben gen Regelmechanismus, das ermöglicht die effektive posttranskritionelle gen-silencing der endogenen sowie Eindringen von DsRNAs in einer Sequenz-spezifische Art und Weise, die schließlich zu die Regulation der Genexpression in der mRNA führt Level^11,12. Kurz, wenn exogene DsRNA in eine Zelle verinnerlicht ist, was sie von einem Mitglied der zweizähnigen Nuklease RNase III-Superfamilie zu SiRNAs verarbeitet wird, genannt Dicer, das evolutionär in Worms, fliegen, Pflanzen, Pilze und Säugetiere^13, konserviert ist ^{14 , 15}. diese 21-25 Nukleotide SiRNA Maisonetten sind dann abgewickelt und integriert im RNA-induced silencing Komplex (RISC) wie RNAs führen. Diese RISC-RNA-Komplex ermöglicht Watson-Crick-Basenpaarung zu den ergänzenden Zielen mRNA; Dies führt schließlich zur Spaltung durch das Argonaut-Protein, ein Multi Domain Protein enthält eine RNase H-ähnliche Domäne, die verschlechtert sich die entsprechende mRNA und Protein Übersetzung, was wiederum zu posttranskritionelle gen-silencing¹⁶ reduziert ^{, 17 , 18}.

RNAi für Pflanzenschutz erfordert die Einführung DsRNA in Vivo das Gen des Interesses, zum Schweigen zu bringen, damit Aktivierung des SiRNA-Weges. Verschiedene Methoden, die für die DsRNA Lieferung an Insekten und Insektenzellen verwendet wurden, um systemische RNAi induzieren gehören Fütterung^10,19,^20,21, Mikroinjektion²², Träger wie Liposomen einweichen ²³und anderen Techniken-²⁴. RNAi war erste gezeigt in Caenorhabditis Elegans , Unc-22 Genexpression durch Feuer zum Schweigen zu bringen und Mello²⁵, gefolgt von Zuschlag im Ausdruck der frittierten Gene in Drosophila Melanogaster²⁶. Funktionale ausgangsstudien genutzt Mikroinjektion DsRNA in Insekten, wie z. B. Apis Mellifera^22,27, Acyrthosiphon Pisum²⁸, Blattella Germanica²⁹zu liefern, H. Halys³⁰und Lepidoptera Insekten (rezensiert von Terenius Et al. ³¹). Mikroinjektion ist vorteilhaft, eine genaue und präzise Dosierung an den Ort von Interesse in das Insekt zu liefern. Wenn auch solche septischen Punktionen Expression immun Verwandte Gene durch Trauma³², daher seine Praxistauglichkeit in landwirtschaftlichen Biopestizide Entwicklung auszuschließen entlocken können.

Eine andere Methode der Bereitstellung von DsRNA in Vivo wird durch einweichen, was einschließt, Verschlucken oder Aufnahme von DsRNA durch Aussetzung der Tiere oder Zellen in der Regel im extrazellulären DsRNA-haltigem Medium. Einweichen wurde verwendet, um effizient induzieren RNAi in Drosophila S2 Gewebekultur Zellen hemmen Downstream von Raf1 (DSOR1) Mitogen-activated Protein Kinase-Kinase (MAPKK)²⁰sowie in C. Elegans die zum Schweigen zu bringen POS-1 gen³³. DsRNA geliefert mit Einweichen ist jedoch weniger effizient im Vergleich zu Mikroinjektion²⁰RNAi induzieren. RNAi vermittelte Stummschaltung in Kauen Insekt wurde erstmals in der Maiswurzelbohrer (WCR) (Diabrotica Virgifera Virgifera) durch Infusion die DsRNA in eine künstliche Agar Diät¹⁰gezeigt. In früheren Berichten haben Methoden zur DsRNA infundiert in natürliche Ernährung speziell für Arthropoden³⁴liefern zusammengefasst. Diese Lieferung Methoden waren weiter entschlossen, vergleichsweise effektiv sein, künstliche Mittel der Lieferung; wie der Fall von der Tsetse-Fliege (Glossina Morsitans Morsitans), wo gleich Knockdown von eine immunvermittelte gen beobachtet wurde als DsRNA entweder durch Blutmehl oder mikroinjiziert³⁵geliefert wurde. Ähnlich, Lieferung von DsRNA durch Tröpfchen in leichte braune Apfel Motte (Epiphyas Postvittana)³⁶, Diamondback Moth (Plutella Xylostella) Larven³⁷sowie Honig Bienen^38,39 effiziente RNAi induziert. Am effektivsten RNAi-Experimente in Hemipteran haben Injektion von DsRNA⁴⁰ verwendet, weil mündliche Lieferung von DsRNA in hemipteran Insekten mühsam ist, da es durch die Wirtspflanze Vascular Gewebe geliefert werden muss. Effektive RNAi wurde auch in AKP-Staaten und glasig-winged Sharpshooter Leafhopper (GWSS), Homalodisca Vitripennisbeobachtet: DsRNA wurde durch Zitrusfrüchten und Weinreben, die in der Vascular Gewebe durch Wurzel durchnässen, Blatt-DsRNA absorbiert hatte geliefert Sprays, Stamm-Injektionen oder Absorption durch Stecklinge^{41,42,43,44,45,46}. Dies führte auch zu das erste Patent für DsRNA gegen die AKP-Staaten (2016, uns 20170211082 A1). Lieferung von SiRNA und DsRNA mit Fluggesellschaften wie Nanopartikel und Liposomen vermittelt Stabilität und Erhöhungen der gelieferten DsRNA Wirksamkeit entstehen schnell^{23,47,48,49 ,50}. Eine neue Klasse von Nanopartikel-basierte auslieferfahrzeuge für Nukleinsäuren für in Vitro und in Vivo , die speziell für therapeutische Anwendungen immenses Potential vermitteln können, wie geeignet Lieferung⁵¹Vektoren zusammengefasst wurde. Nanopartikel als Träger für DsRNA möglicherweise Nachteile einschließlich Löslichkeit, Hydrophobie oder begrenzte Bioakkumulation⁵², aber eine geeigneten Polymers Unterstützung Lieferung kann diese Nachteile zu kompensieren. Entwicklung und Nutzung von selbst liefern Nukleotiden entstehen auch genannt “antisense Oligonukleotide”, die einzigen stranded RNA/DNA Duplex⁴⁶sind.

Vitellogenesis in Arthropoden ist ein Schlüssel Prozess Steuerung Reproduktion und Juvenilhormon (JH) oder Ecdyson geregelt, die sind die wichtigsten Induktoren der Vg Synthese von Körperfett; Das Vg wird schließlich von der entwickelnden Eizelle über Vg Rezeptor-vermittelte Endozytose⁵³aufgenommen. VG ist eine Gruppe von Polypeptiden synthetisiert Extraovarially, die wesentlich für die Entwicklung der großen Ei Eigelb Eiweiß, Vitellin^54,55, und daher ist es wichtig bei der Fortpflanzung und Alterung⁵⁶. VG hat erfolgreich zum Schweigen gebracht worden in Nematoden⁵⁷ sowie in Honigbiene (Apis Mellifera) wo RNAi Erschöpfung der Vg vermittelte in Erwachsene und Eiern²²beobachtet wurde. RNAi vermittelte posttranskritionelle gen-silencing VG wurde getestet, weil man dachte, dass seine Erschöpfung führe zu einem beobachtbaren phänotypische Wirkung wie verringert Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit, um potenziell BMSB Kontrolle zu helfen. Das JHAMT-gen, das die S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) kodiert-abhängige JH Säure O-Methyltransferase katalysiert den letzten Schritt der JH Biosynthese Weg⁵⁸. In diesem Pfad Farnesyl Pyrophosphat (FPP) nacheinander von Farnesol, Farnesoic Säure, gefolgt von der Umwandlung von Methyl-Farnesoate, JH durch JHAMT wandelt sich. Dieser Weg ist konserviert in Insekten und Arthropoden speziell für Metamorphose, ein Prozess, der Hormone^59,60,61Entwicklungsgeschichtlich geregelt ist. In B. Morizufolge JHAMT Genexpression und die JH biosynthetische Aktivität in den Corpora Allata die transcriptional Unterdrückung des JHAMT -Gens für die Beendigung der JH Biosynthese⁵⁸entscheidend. Daher wurden die JHAMT und Vg Gene für gezielte Erschöpfung mit RNAi ausgewählt. RNAi wurde auch Zitrusbäume für die Kontrolle der AKP-Staaten und GWSS getestet. Zitrusbäume mit DsRNA durch Wurzel durchnässen behandelt wurden, ergeben sich Hahn (Stamm Injektionen), sowie Blatt-Sprays mit DsRNAs gegen Insekten bestimmte Arginin Kinase (AK) Abschriften^42,44. Die topische Anwendung von DsRNA erkannt wurde überall auf dem Vordach der Zitrusbäume, effiziente Lieferung durch die Pflanzen Vascular Gewebe angibt, und führte zu erhöhten Mortalität in den AKP-Staaten und GWSS^{41,42, 45}.

In der aktuellen Studie haben wir eine natürliche Ernährung Übermittlungsmethode für Behandlungen wie DsRNA identifiziert. Diese neu entwickelte Technik diente anschließend für die JHAMT und Vg-Stummschaltung mit spezifischen DsRNAs gen in BMSB Nymphen als mRNA zeigten frühere⁶². Diese neue Übermittlungsprotokolle demonstriert hier ersetzen konventionelle RNA-Delivery-Systeme, die topischen Sprays oder Mikroinjektionen verwenden. Obst und Gemüse, Stamm Hahn, Boden Tränken und Ton Absorptionsmittel in können verwendet werden für die Lieferung von DsRNA, die ist entscheidend für die weitere Entwicklung der Schädlinge und Krankheitserreger Management verwand.

Protocol

(1) BMSB Aufzucht Hintere BMSB Insekten gemäß standard-Lab-Praxis und zuvor beschriebenen63. ACP (D. Citri) Insekten auf Citrus Macrophylla in einem Gewächshaus (22 ° C) und natürliches Licht zu erhöhen. Verwenden Sie Erwachsene ACP, bei ca. 5-7 Tage post bewegungsapparate. 2. Auswahl der Genregionen und In vitro- Synthese von dsRNA Wählen Sie bestimmte Gene BMSB aus bereits veröffentlichten Transkri…

Representative Results

Pflanzlichen vermittelten DsRNA Lieferung durch Fütterung in BMSB 4th Instar Nymphen wurde für die Entwicklung der molekularen Biopestizide mit RNAi für invasive Schädlinge getestet. BMSBs Feed mit ihren nadelartigen Stilett durch einen Mechanismus bekannt als Zerfleischen und spülen, wodurch erhebliche Schäden an Kulturpflanzen. Schlanke Bio grüne Bohnen, p. Vulgaris L., wurden verwendet, um zu testen, ob Nährstoffe oder DsRNA in Vivo an BMSB durch F?…

Discussion

RNAi erweist sich ein wichtiges Instrument für die Erkundung von Gen biologische Funktion und Regulation, mit großem Potenzial für die Verwaltung von Schadinsekten^19,68,69,70, genutzt werden ⁷¹. das Design und die Auswahl an eine geeignete ursächlich für eine bestimmten Insektenarten und die Art der Zustellung der entsprechenden DsRNA(s) auf das Insekt St…

Materials

BMSB (H. halys) insects	USDA
ACP (D. citri) insects	USDA
organic green beans	N/A
Citrus plants	USDA
sodium hypochlorite solution	J.T. Baker
green food coloring	McCormick & Co., Inc
Thermo Forma chambers	Thermo Fisher Scientific
Magenta vessel (Culture)	Sigma
Primers	IDT DNA
SensiMix SYBR	Bioline
qPCR ABI 7500	Applied Biosystems
Spray bottle	N/A
Parafilm	American Can Company
TaKaRa Ex Taq	Clontech
QIAquick	Qiagen