Optimaliseren van het gebruik van een Liquid Handling Robot uit te voeren van een hoge doorvoersnelheid vooruit chemische genetica scherm van Arabidopsis thaliana
Summary
Een scherm met hoge doorvoersnelheid van synthetische kleine moleculen vond plaats op de model plantensoorten, Arabidopsis thaliana. Dit protocol, ontwikkeld voor een liquid handling robot, verhoogt de snelheid van voorwaartse chemische genetica schermen, versnellen van de ontdekking van nieuwe kleine moleculen beïnvloeden de plantenfysiologie.
Abstract
Chemische genetica wordt steeds ingezet om te decoderen van eigenschappen in planten die recalcitrante tot de traditionele genetica als gevolg van gen redundantie of letaliteit worden kunnen. Echter, de waarschijnlijkheid van een synthetische klein molecuul wordt bioactieve is laag; Daarom moeten duizenden moleculen worden getest om te vinden die van belang. Vloeistof behandeling robotics systemen zijn ontworpen om het verwerken van grote aantallen monsters, verhoging van de snelheid waarmee een chemische bibliotheek naast het minimaliseren/standaardiseren fout kan worden vertoond. Om een scherm high-throughput voorwaartse chemische genetica van een bibliotheek van 50.000 kleine molecules op Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocollen met behulp van een bank-top meerkanaals vloeistof waarvoor minimale handling robot werden ontwikkeld de betrokkenheid van de technicus. Met deze protocollen, werden de 3,271 kleine moleculen ontdekt dat zichtbaar fenotypische veranderingen veroorzaakt. 1,563 verbindingen geïnduceerde korte wortels, 1,148 verbindingen gewijzigd kleuring, 383 verbindingen veroorzaakt root haren en andere, niet-gecategoriseerd, verbouwingen en 177 verbindingen geremd kiemkracht.
Introduction
In de afgelopen 20 jaar hebben onderzoekers op het gebied van plantenbiologie grote vooruitgang met behulp van chemische genetica benaderingen, zowel voorwaartse als terugwaartse, geboekt verbetering van ons begrip van de celwand biosynthese, het cytoskelet, een hormoon biosynthese en signalering, Geotropie, pathogenese purine biosynthese en mensenhandel1,2,,3,,4,5endomembrane. Voorwaartse chemische genetica technieken maakt de identificatie van de fenotypen van belang en onderzoekers te begrijpen van de genotypische onderbouwing van bepaalde processen toestaat. Omgekeerde chemische genetica is daarentegen opzoekt van chemische stoffen die interactief met een vooraf bepaald eiwit doelstelling6 werken. Arabidopsis is in de voorhoede van deze ontdekkingen in plantenbiologie omdat haar genoom klein, is toegewezen en van aantekeningen voorzien. Het heeft een korte generatietijd, en er zijn meerdere mutant/verslaggever lijnen beschikbaar om de identificatie van afwijkende subcellular machines7te vergemakkelijken.
Er zijn twee belangrijke knelpunten die vertragen de voortgang van voorwaartse chemische genetische schermen eerste screening proces en het bepalen van het doel van de samengestelde rente8. Een belangrijke hulp bij het vergroten van de snelheid van klein molecuul selectie is het gebruik van automatisering en geautomatiseerde apparatuur9. Liquid handling-robots zijn een uitstekend hulpmiddel voor het afhandelen van grote bibliotheken van kleine moleculen en instrumenteel in het rijden van vooruitgang in de biologische wetenschappen10geweest. Het hier gepresenteerde protocol is ontworpen om te verzachten de bottleneck verbonden aan het screeningsproces, waardoor de identificatie van bioactieve kleine moleculen in een snel tempo. Deze techniek vermindert de belasting van arbeid en tijd namens de exploitant terwijl ook het verminderen van de economische kosten voor de onderzoeker principe.
Tot nu toe de meeste chemische bibliotheken geanalyseerd hebben gehouden tussen 10.000 en 20.000 verbindingen, sommigen met maar liefst 150.000 en sommige met zo weinig als 709,11,12,13,14, 15 , 16. het protocol hierin geïntroduceerd werd uitgevoerd op een klein molecuul bibliotheek van 50.000 verbindingen (Zie Tabel of Materials), een van de grotere voorwaartse chemische genetica schermen uitgevoerd op Arabidopsis tot nu toe. Dit protocol past bij de huidige trend naar meer efficiëntie en snelheid met betrekking tot de voorwaartse chemische genetica, met name als het gaat om herbicide ontdekking, ontdekking van de insecticide, fungicide ontdekken, drug discovery and Kankerbiologie17 ,18,19,20,21. Hoewel ze hier zijn geïmplementeerd met Arabidopsis, kan dit protocol, gemakkelijk worden aangepast aan celculturen, sporen, en mogelijk zelfs insecten in vloeistof binnen 96-, 384 of 1536-Wells-platen. Vanwege zijn kleine omvang is Arabidopsis vatbaar voor screening in 96 goed platen. Echter is het verspreiden van zaden gelijkmatig onder wells een uitdaging. Hand loting klopt maar arbeidsintensief, en hoewel er inrichtingen die zijn ontworpen zijn om het uitdelen van zaden in 96-wells-platen, ze zijn duur om te kopen. Hier, laten we zien hoe deze stap kan worden omzeild met slechts een klein verlies in nauwkeurigheid.
Het algemene doel van deze methode is dat een grote chemische bibliotheek tegen Arabidopsis handelbaarder, zonder afbreuk te doen aan de nauwkeurigheid, via het gebruik van een liquid handling robot screening. Het gebruik van deze methode verbetert de efficiency van de onderzoeker door het verminderen van de tijd genomen om het volledige beheer van de reeks van de eerste verdunning en daaropvolgende fenotypische schermen, waardoor snelle visualisatie van monsters onder een Microscoop ontleden, en snelle identificatie van nieuwe bioactieve kleine moleculen. Figuur 1 toont de belangrijkste resultaten van dit protocol in 4 stappen.
Figuur 1: totale workflow van het scherm naar voren chemische genetica. Een overzicht van het protocol bij met één of ander detail voor elk van de 4 belangrijkste stappen worden beschreven. 1: ontvangst van de chemische bibliotheek, 2: maken de verdunning bibliotheek, 3: maken de Screening platen, en 4: broeden en visualiseren van de Screening platen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is ontworpen om steun van onderzoekers in het volbrengen van een voorwaartse chemische genetica scherm op Arabidopsis. Wij bieden representatieve resultaten van een scherm van 50.000 verbindingen (Figuur 2 en Figuur 3), een van de grootste voorwaartse chemische genetica schermen op Arabidopsis tot op heden9,13,23uitgevoerd. Het gebruik van een liquid handli…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Jozsef Stork, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue en Andrea Sanchez voor constructieve en kritische discussie. Dr. Sharyn Perry voor de fenotypische foto’s. Dit materiaal is gebaseerd op werk gesteund door de National Science Foundation onder coöperatie overeenkomst nr. 1355438.
Materials
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- . Seed Handling Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013)
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
