高スループット転送化学遺伝学の画面シロイヌナズナを行う液体処理ロボットの使用を最適化します。
Summary
合成小分子の高スループット画面は、モデル植物シロイヌナズナの行われました。液体ハンドリング ロボットの開発、このプロトコルは、前方の化学遺伝学スクリーン、植物生理に影響を与える小さな分子の発見を加速の速度を上げます。
Abstract
化学遺伝学はますます伝統的な遺伝学遺伝子重複や致死性のために手に負えないことができる植物の形質をデコードに採用されています。ただし、生理活性されている合成小分子の確率が低いです。したがって、分子の数千人は、関心のあるものを見つけるためにテストする必要があります。リキッドハンド ロボット システム、エラーの最小化/標準化に加えて化合物ライブラリーをスクリーニングする速度を増加させるサンプルの大規模な数を処理する設計されています。ベンチ上のマルチ チャンネル液体を用いたプロトコルシロイヌナズナ(シロイヌナズナ) に 50,000 の小分子のライブラリの高スループット転送化学遺伝学画面を達成するために最小限必要とする開発されたハンドリング ロボット技術者の関与です。これらのプロトコルで目に見える表現型の変化を引き起こした 3,271 小分子を発見されました。1,563 化合物による短い根、変更 1,148 化合物着色、383 化合根毛と他、非分類変更と発芽抑制 177 化合物。
Introduction
過去 20 年間で植物学の分野の研究者長足化学遺伝学アプローチ、フォワードおよびリバースを使用して細胞壁生合成、細胞骨格、ホルモンの生合成の私達の理解を改善し、シグナル伝達、重力屈性、病態、プリン生合成、内1,2,3,4,5を人身売買します。前方の化学遺伝学手法を用いた関心の表現型の識別し特定のプロセスの遺伝的基盤を理解する研究者ができます。逆に、逆の化学遺伝学は、事前に決められた蛋白質ターゲット6と対話する化学物質を求めています。シロイヌナズナは、マップ、および注釈、そのゲノムは小さいためプラント生物学のこれらの発見の最前線にされています。短い世代時間があり、異常な細胞内機械7の識別を容易に利用可能な複数の変異/記者行があります。
前方の化学遺伝学的画面の進行状況、初期審査と金利8化合物のターゲットを決定する 2 つの主要なボトルネックがあります。小分子選択の速度の増加の主要な援助は、自動化と自動機器9の使用です。液体ハンドリング ロボットは小分子の大規模なライブラリを処理するための優れたツールを生物科学10で進行中の運転に尽力しています。ここで提示されたプロトコルは.の急速なペースで生理活性小分子の同定を有効化審査に関連するボトルネックを軽減するために設計されていますこの手法は、労力とも原則として探偵に経済的なコストを減らしている間オペレーターに代わって時間の負担を減少します。
これまでほとんどの化学ライブラリ分析は 10,000 のそして 20,000 化合物として 150,000 と 709,11,12,13,14,ようないくつかのいくつかの間抱いてください。15,16. ここに紹介されたプロトコル (材料表参照) 50,000 化合物の小分子ライブラリで実装されていました、これまでに実施したシロイヌナズナの画面より大きい前方化学遺伝学の一つ。このプロトコルは除草剤検出、発見殺虫剤、殺菌剤に関連した特に効率性の向上と前方の化学遺伝学に関する速度の現在の傾向とフィットを発見、創薬、・がん生物学17 ,18,19,20,21。実装されているシロイヌナズナと、このプロトコルでは、簡単にできる培養細胞、胞子、および可能性のある昆虫に適応 96-、384 – または 1536 ウェル プレート内液体培地で。サイズが小さいため、シロイヌナズナ、96 ウェル プレートでのスクリーニングを受けやすい。ただし、井戸の間で均等に種子を配布するは難しい問題です。手播種は労働集約的、正確、96 ウェルのプレートに種子を分配する機器がありますが、購入する高価。ここでは、精度で小さな損失だけでこのステップを回避できる方法を示す.
このメソッドの全体的な目標は、経由での使用液体ハンドリング ロボットの精度を損なうことがなくより管理しやすいシロイヌナズナに対する大規模な化合物ライブラリーをスクリーニングすることでした。このメソッドを使用して初期希釈シリーズ管理と解剖顕微鏡の下で迅速なサンプルの迅速な視覚化を許可以降の表現型画面を完了するのにかかる時間を減少させることによって研究者の効率を改善します。新規生理活性小分子の同定。図 1は、4 つのステップでこのプロトコルの主要な成果を示しています。
図 1: 前方の化学遺伝学画面の全体的なワークフロー 。4 主な手順のそれぞれのいくつかの詳細を説明するプロトコルの概要です。1: 化学ライブラリ、2 を受信: 3 希釈ライブラリを作る: スクリーニング プレートと 4: インキュベートとスクリーニング プレートを可視化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、シロイヌナズナの前方の化学遺伝学画面を達成するために研究者を支援するために設計されています。我々 は、代表的な結果を提供するまでに9,13,23シロイヌナズナの実行最大の前方の化学遺伝学スクリーンの 1 つ 50,000 化合物 (図 2および図 3) の画面から。…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
建設的な議論、Jozsef コウノトリ、ミッチェル リッチモンド、Jarrad Gollihue とアンドレア ・ サンチェスに感謝します。表現型の写真のため博士 Sharyn ペリー。この材料は、組合契約第 1355438 の下での国立科学財団によってサポートされる作業に基づいています。
Materials
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- McCourt, P., Desveaux, D. Plant chemical genetics. New Phytol. 185 (1), 15-26 (2010).
- Lumba, S., Cutler, S., McCourt, P. Plant nuclear hormone receptors: A role for small molecules in protein-protein interactions. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 445-469 (2010).
- Hicks, G. R., Raikhel, N. Opportunities and challenges in plant chemical biology. Nat Chem Biol. 5 (5), 268-272 (2009).
- De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat Chem Biol. 8 (9), 798-805 (2012).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).
- Serrano, M., Kombrink, E., Meesters, C. Considerations for designing chemical screening strategies in plant biology. Front Plant Sci. 6, 131 (2015).
- Yoshitani, N., et al. A structure-based strategy for discovery of small ligands binding to functionally unknown proteins: Combination of in silico screening and surface plasmon resonance measurements. Proteomics. 5 (6), 1472-1480 (2005).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- DeBolt, S., et al. Morlin, an inhibitor of cortical microtubule dynamics and cellulose synthase movement. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5854-5859 (2007).
- Christian, M., Hannah, W. B., Luthen, H., Jones, A. M. Identification of auxins by a chemical genomics approach. J Exp Bot. 59 (10), 2757-2767 (2008).
- Drakakaki, G., et al. Clusters of bioactive compounds target dynamic endomembrane networks in vivo. PNAS. 108 (43), 17850-17855 (2011).
- Armstrong, J. I., Yuan, S., Dale, J. M., Tanner, V. N., Theologis, A. Identification of inhibitors of auxin transcriptional activation by means of chemical genetics in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14978-14983 (2004).
- Brown, L. A., et al. A small molecule with differential effects on the PTS1 and PTS2 peroxisome matrix import pathways. Plant J. 65 (6), 980-990 (2011).
- De Rybel, B., et al. Chemical inhibition of a subset of Arabidopsis thaliana GSK3-like kinases activates brassinosteroid signaling. Chem Biol. 16 (6), 594-604 (2009).
- Arkin, M. R., Tang, Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing toward the reality. Chem Biol. 21 (9), 1102-1114 (2014).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nat Chem Biol. 3 (11), 716-721 (2007).
- Walsh, T. A. The emerging field of chemical genetics: Potential applications for pesticide discovery. Pest Manag Sci. 63 (12), 1165-1171 (2007).
- . Seed Handling Available from: https://abrc.osu.edu/seed-handling (2013)
- Knoth, C., Salus, M. S., Girke, T., Eulgem, T. The synthetic elicitor 3,5-dichloroanthranilic acid induces NPR1-dependent and NPR1-independent mechanisms of disease resistance in Arabidopsis. Plant Physiol. 150 (1), 333-347 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well Plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. J Vis Exp. , (2015).
- Daniszewski, M., et al. Automated cell culture systems and their applications to human pluripotent stem cell studies. SLAS Technol. , (2017).
- Popa-Burke, I., Russell, J. Compound precipitation in high-concentration DMSO solutions. J Biomol Screen. 19 (9), 1302-1308 (2014).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. Cold Spring Harb Protoc. , (2017).
