높은 처리량 앞으로 화학 유전학의 화면 애기 thaliana 을 액체 처리 로봇의 사용을 최적화
Summary
합성 작은 분자의 높은 처리량 화면 모델 식물 종, 애기 thaliana에 실시 됐다. 액체 처리 로봇에 대 한 개발이 프로토콜 앞으로 화학 유전학 스크린, 식물 생리학에 영향을 미치는 새로운 작은 분자의 발견을 가속의 속도가 증가 합니다.
Abstract
화학 유전학은 점점 해독 식물 유전자 중복 또는 치 전통 유전학에 고집 불통 될 수 있는 특성을 채용 되 고 있습니다. 그러나, 생리 되는 합성 분자의 확률이 낮습니다; 따라서, 분자의 수천은 그 관심을 찾기 위해 테스트 되어야 한다. 액체 처리 로봇 시스템은 샘플, 속도는 화학 라이브러리 오류 최소화/표준화 이외에 상영 될 수 증가의 큰 숫자를 처리 하기 위해 설계 되었습니다. 벤치 탑 멀티 채널 액체를 사용 하 여 프로토콜 애기 thaliana (애기)에 50000 작은 분자의 도서관의 높은 처리량 앞으로 화학 유전학 스크린을 달성 하기 위해 필요한 최소한의 개발 되었다 로봇을 처리 기술 자가 참여. 이러한 프로토콜을 3,271 작은 분자는 그 표시 phenotypic 변경 발생 발견 되었다. 1,563 화합물 짧은 뿌리, 1,148 화합물 변경 채색, 383 화합물 발생 루트 머리와 다른, 비-, 분류 변경 및 177 화합물 저해 발 아를 유도 한다.
Introduction
지난 20 년 동안에서 식물 생물학 분야에서 연구자는 큰 진전을 화학 유전학 방법, 앞으로 및 역방향, 세포 벽 생 합성, 골격, 호르몬 생 합성에 대 한 우리의 이해를 개량 하 고 신호, gravitropism, 병 인, 퓨 린 생 합성, 그리고 endomembrane,12,3,,45를 인신 매매. 앞으로 화학 유전학 기술을 관심의 고기 식별 가능 하며 특정 프로세스의 genotypic 토대를 이해 연구 반대로, 반대로 화학 유전학 미리 결정된 단백질 대상6상호 작용 하는 화학 물질을 찾고 있습니다. 애기 때문에 매핑되고 주석 그것의 게놈은 작은, 식물 생물학에서 이러한 발견의 최전선에 왔다. 그것은 짧은 생성 시간, 그리고 여러 돌연변이/기자 라인 탈 subcellular 기계7의 식별을 용이 하 게 사용할 수 있다.
천천히 앞으로 화학 유전 스크린의 진행, 초기 심사 과정 및 관심8의 화합물의 목표를 결정 하는 두 가지 주요 병목을 확인 하 고 있습니다. 작은 분자 선택의 속도 증가에서 주요 원조 자동화 및 자동화 된 장비9의 사용 이다. 액체 처리 로봇 작은 분자의 큰 도서관을 처리 하기 위한 훌륭한 도구입니다 그리고 생물 과학10에서 진행을 운전에 도움이 되었습니다. 여기에 제시 된 프로토콜은. 빠른 속도로 생리 활성 작은 분자의 식별 사용 심사 프로세스와 관련 된 병목을 완화 하도록 설계 되었습니다. 이 기술은 노동의 원리 탐정에 경제적 비용 감소 연산자 대신 시간 부담 감소.
지금까지, 대부분의 화학 라이브러리 분석으로 150, 000와 일부 몇 가지 709,,1112,,1314, 로 일부 10000 그리고 20000 화합물 사이 개최 15 , 16. 여기 소개 하는 프로토콜 ( 재료의 표참조) 50000 화합물의 분자 라이브러리에 구현 된, 더 큰 앞으로 화학 유전학 중 화면 날짜에 실시 애기. 이 프로토콜 발견 제 초 제, 살충제의 발견, 살 균 제에 관련 된으로 특히 증가 효율성과 속도 앞으로 화학 유전학에 관한 현재 트렌드에 맞는 발견, 발견, 및 암 생물학17 마약 ,,1819,,2021. 비록 여기 애기와 구현,이 프로토콜을 쉽게 될 수 세포 배양, 포자, 그리고 잠재적으로 심지어 곤충을 96-384 / 1536-잘 접시에서 액체 매체에서. 작은 크기로 인해 애기는 의무가 96 잘 접시에서 심사. 그러나, 우물에 고르게 씨앗 배포는 도전 이다. 손 시드 노동 집약, 하지만 정확한 이며 96 잘 접시에 씨앗을 분배 하도록 하는 장치는, 그들은 저렴 하 게 구입할. 여기, 우리가 어떻게이 단계 피할 수 단지 작은 손실 정확도에 보여줍니다.
이 방법의 전반적인 목표는 애기 더 관리에 대 한 큰 화학 라이브러리 사용을 통해 액체 처리 로봇의 정확도 저하 없이 심사 수 있도록 했다. 이 메서드를 사용 하 여 초기 희석 시리즈 관리 및 후속 phenotypic 화면, 빠른 시각화 해 현미경 그리고 급속 한 샘플의 수를 완료 하는 데 걸린 시간을 감소 하 여 연구원의 효율성 향상 새로운 생리 활성 작은 분자의 id입니다. 그림 1 4 단계에서이 프로토콜의 주요 결과를 보여 줍니다.
그림 1: 앞으로 화학 유전학 스크린의 전체 워크플로. 4 주요 단계의 각각에 대 한 몇 가지 세부 사항에 설명 하는 프로토콜의 개요. 1: 화학 라이브러리, 2 수신: 3 희석 라이브러리 만들기: 심사 접시, 및 4: 잠복기 및 심사 번호판을 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 애기에 앞으로 화학 유전학 스크린 달성에 연구자를 지원 하도록 설계 되었습니다. 우리가 제공 하는 대표적인 결과 50000 화합물 (그림 2 및 그림 3)의 화면에서 가장 큰 앞으로 화학 유전학 스크린 중의 하나는9,,1323날짜에 애기에 수행. 액체 처리 로봇의 사용에는 더 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리가 건설 하 고 중요 한 토론을 위한 Jozsef 황새, 미첼 리치몬드, Jarrad Gollihue, 그리고 안드레아 산체스 감사합니다. Phenotypic 사진에 대 한 박사 Sharyn 페리입니다. 이 자료는 협력 계약 번호 1355438에서 국립 과학 재단에서 지 원하는 작업을 기반으로 합니다.
Materials
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
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