Otimizando o uso de um robô de manipulação líquidos para conduzir a uma alta taxa de transferência para a frente química genética tela de Arabidopsis thaliana
Summary
Realizou-se uma tela de alta taxa de transferência de moléculas pequenas sintéticas sobre espécies a planta modelo Arabidopsis thaliana. Este protocolo, desenvolvido para um robô de manipulação de líquidos, aumenta a velocidade das telas de genética de química para a frente, acelerando a descoberta de novas moléculas pequenas, que afetam a fisiologia vegetal.
Abstract
Química genética é cada vez mais sendo empregada para decodificar traços nas plantas que podem ser recalcitrantes à genética tradicional devido à redundância de gene ou letalidade. No entanto, a probabilidade de uma pequena molécula sintética, sendo bioativos é baixa; Portanto, milhares de moléculas devem ser testados a fim de encontrar aqueles de interesse. Robótica, sistemas são projetados para lidar com um grande número de amostras, aumentando a velocidade com que uma biblioteca de química pode ser rastreada além de minimizar/padronização erro de manuseio de líquidos. Para obter uma tela de alta produtividade para a frente química genética de uma biblioteca de 50.000 moléculas pequenas em Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), protocolos usando um líquido de multicanal de bancada manipulação robô foram desenvolvidos que exigem mínima envolvimento de técnico. Com estes protocolos, 3.271 pequenas moléculas foram descobertas que causou alterações fenotípicas visíveis. 1.563 compostos induziram raízes curtas, coloração 1.148 compostos alterados, 383 compostos causados raiz do cabelo e outras, não-Categorizado, alterações e germinação de 177 compostos inibidas.
Introduction
Nos últimos 20 anos pesquisadores no campo da biologia vegetal tem feito grandes progressos usando abordagens química genética, tanto para diante e reversos, melhorando nossa compreensão da biossíntese da parede celular, o citoesqueleto, a biossíntese do hormônio e sinalização, geotropismo, patogênese, biossíntese de purinas e endomembranoso tráfico1,2,3,4,5. Empregando técnicas de genética para a frente de química permite a identificação de fenótipos de interesse e permite que os pesquisadores a entender os fundamentos genotípicos de processos particulares. Por outro lado, genética química inversa procura produtos químicos que interagem com uma proteína pré-determinado alvo6. Arabidopsis tem sido na vanguarda destas descobertas em biologia vegetal, porque o seu genoma é pequena, mapeado e anotado. Tem um tempo de geração curto, e existem várias linhas de mutante/repórter disponíveis para facilitar a identificação de máquinas subcellular aberrante7.
Existem dois grandes estrangulamentos que retardar o progresso da frente químicas genéticas telas, inicial processo de triagem e determinar o destino do composto de interesse8. Uma grande ajuda no aumento da velocidade de seleção pequena molécula é o uso de automação e equipamentos automatizados9. Robôs de manipulação de líquido são uma excelente ferramenta para a manipulação de grandes bibliotecas de moléculas pequenas e têm sido fundamentais para dirigir o progresso da ciências biológicas10. O protocolo aqui apresentado é projetado para aliviar o gargalo associado com o processo de seleção, permitindo a identificação de moléculas bioativas de pequenas em uma taxa rápida. Esta técnica diminui a carga de trabalho e tempo em nome do operador, enquanto também, diminuindo o custo econômico para o investigador de princípio.
Até então, bibliotecas mais químicas analisadas realizaram entre 10.000 e 20.000 compostos, alguns com até 150.000 e alguns com tão poucos como 709,11,12,13,14, 15 , 16. o protocolo apresentado neste documento foi implementado em uma biblioteca pequena molécula de 50.000 compostos (ver Tabela de materiais), um dos maiores genética química frente ecrãs conduzidos em Arabidopsis até à data. Este protocolo se encaixa com a atual tendência para aumentar a eficiência e velocidade sobre genética de química para a frente, especialmente no que tange a descoberta de herbicida, descoberta de inseticida, fungicida descubra, droga descoberta e a biologia do câncer17 ,18,19,20,21. Embora implementado aqui com Arabidopsis, este protocolo, poderia ser facilmente adaptadas às culturas de células, esporos e potencialmente até insetos em meio líquido, dentro de 96, 384- ou placas boas 1536. Devido ao seu pequeno tamanho, Arabidopsis é passível de triagem em 96 placas bem. No entanto, distribuir sementes uniformemente entre poços é um desafio. Semeadura de mão é preciso mas mão de obra intensiva, e embora existam dispositivos projetados para dispensar as sementes em placas de 96 poços, eles são caros para comprar. Aqui, nós mostramos como este passo pode ser contornado com apenas uma pequena perda de precisão.
O objetivo geral deste método era fazer a triagem de uma grande biblioteca de química contra Arabidopsis mais gerenciável, sem comprometer a precisão, através do uso de um robô de manipulação de líquidos. O uso desse método melhora a eficiência do pesquisador, diminuindo o tempo levado para completar a gestão de séries de diluição inicial e subsequentes telas fenotípicas, permitindo a visualização rápida de amostras sob um microscópio de dissecação e rápida identificação de novas moléculas pequenas bioativas. A Figura 1 mostra os resultados-chave do presente protocolo em 4 passos.
Figura 1: fluxo de trabalho geral da tela frente química genética. Uma visão geral do protocolo a ser descrito com algum detalhe para cada uma das 4 principais etapas. 1: receber a biblioteca química, 2: fazendo a biblioteca de diluição, 3: fazendo as placas de triagem e 4: incubar e visualizando as placas de triagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo é projetado para ajudar os pesquisadores a conseguir uma tela frente química genética em Arabidopsis. Nós fornecemos resultados representativos de uma tela de 50.000 compostos (Figura 2 e Figura 3), uma das maiores telas frente química genética realizada em Arabidopsis até à data de13,9,23. O uso de um robô de manipulação líquido habilitado ma…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a cegonha Jozsef, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue e Andrea Sanchez para discussão crítica e construtiva. Dr. Sharyn Perry para as fotografias fenotípicas. Este material é baseado em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob cooperativa acordo n. º 1355438.
Materials
| Keyboard | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Mouse | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer Screen | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| Computer | Local Provider | N/A | Used for protocol design and operating the Biomek FX |
| DIVERSet Diverse Screening Library | ChemBridge | N/A | Chemical library |
| Biomek Software | Beckman Coulter | N/A | Runs and designs the Biomek FX |
| Device Controller | Beckman Coulter | 719366 | Operates the water pump/tip washing station |
| Stacker Carousel Pendent | Beckman Coulter | 148240 | Manual operation of Biomek Stacker Carousel |
| Biomek Stacker Carousel | Beckman Coulter | 148520 | Rotary unit that houses all FX Stacker 10's |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| FX Stacker 10 | Beckman Coulter | 148522 | Elevator unit that houses components for screen |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | Robot that performs the desired operations |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | Frames arm to place components corretly |
| Framing Fixture | Beckman Coulter | 719415 | Centers arm in the Accuframe |
| Multichannel Tip Wash ALP | Beckman Coulter | 719662 | Washes the tips after the ethanol bath |
| Tip Loader ALP | Beckman Coulter | 719356 | Pneumatically loads tips onto the arm |
| Air Compressor | Local Provider | N/A | Provides air for pneumatic tip loading |
| MasterFlex Console Drive | Cole-Parmer | 77200-65 | Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer |
| Air Hose | Local Provider | N/A | Provides air from air compressor to Tip Loader |
| Water Hose | Local Provider | N/A | Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer |
| Static ALP's | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Supports equipment for the Screen |
| 5 Gallon Reserviour | Local Provider | N/A | Recirculates the dirty water from cleaning the tips |
| Grippers | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Grabs and moves the equipment to the correct places |
| 96-Channel 200 µL Head | Beckman Coulter | Comes with Biomek FX | Holds the 96 tips used within the screen |
| AP96 P200 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717251 | Used to make the screening library |
| 96 Well Flat Bottom Plate | Costar | 9018 | Aids in visulization of screen |
| 96 Well V-Bottom Plate | Costar | 3897 | Aids in storing of dilution library |
| AlumaSeal 96 Sealing Film | MedSci | F-96-100 | Seals for storage both the chemicle library and dilution library |
| Plastic ziplock sandwich bags | Local Provider | N/A | Used to ensure a humid environment for screen |
| AP96 P20 Pipette Tips | Beckman Coulter | 717254 | Used in the dilution library creation |
| Growth Chamber | Percival | AR36L3 | Germinates seeds for phenotypic visulization |
| Spatula | Local Provider | N/A | Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly |
| Toothpick | Local Provider | N/A | Pushes seeds from spatula to wells |
| Murashige and Skoog Basal Salt Mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Add to MS media mixture |
| MES Free Acid Monohydrate | Fisher Scientific | ICN19483580 | Added to MS media to decrease pH |
| Agar Powder | Alfa Aesar | 9002-18-0 | Increases thickness of media to support seed suspension |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | Increases pH to adequate levels |
| 1L Media Storage Bottle | Corning | 1395-1L | Holds enough media for a screen |
| Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 431470 | Sterilizes seeds prior to vernilization |
| pH Probe | Davis Instruments | YX-58825-26 | Used for making media |
| ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual | Beckman Coulter | PN 987836 | Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX |
| Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide | Beckman Coulter | 609862-AA | Aids in setting up the Stacker Carousel |
| Biomek FX and FXP Laboratory Automation Workstations Users Manual | Beckman Coulter | PN 987834 | Used to frame the Multichannel Pod |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide | Beckman Coulter | PN B32335AB | Used to aid in setting up the Biomek FX |
| Biomek Software User's Manual | Beckman Coulter | PN 987835 | Used to set up and understand the Software |
References
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