Utredning av Protein rekrytering till DNA lesioner med 405 Nm Laser mikro-bestrålning
Summary
Studera DNA skador reparation kinetik kräver ett system att inducera lesioner vid definierade sub nukleära regioner. Vi beskriver en metod för att skapa lokaliserade dubbelsträngat raster med laserskanning confocal Mikroskop utrustad med en 405 nm laser och tillhandahålla automatiserade procedurer för att kvantifiera dynamiken i reparation faktorer vid dessa skador.
Abstract
DNA skador svar (DDR) använder en uppsjö av proteiner för att upptäcka, signal och reparera DNA lesioner. Avgränsar detta svar är avgörande att förstå genomet underhåll mekanismer. Eftersom rekrytering och utbyte av proteiner vid lesioner är mycket dynamisk, kräver deras studie förmågan att generera DNA-skador i en snabb och rumsligt-avgränsat sätt. Här, beskriver vi procedurer för att lokalt inducerar DNA-skador i mänskliga celler med allmänt tillgängliga laserskanning confocal Mikroskop utrustad med en 405 nm laserlinje. Ansamling av genomet underhåll faktorer på laser ränder kan bedömas genom immunofluorescens (om) eller i realtid med hjälp av proteiner med fluorescerande reportrar etiketten. Använda fosforyleras Histon H2A. X (γ-H2A.X) och replikering Protein A (RPA) som markörer, metoden ger tillräcklig upplösning att diskriminera lokalt rekryterade faktorer från dem som sprids på intilliggande kromatin. Vi tillhandahåller ytterligare ImageJ-baserade skript för att effektivt övervaka kineticsen av protein relocalization på DNA skada platser. Dessa förbättringar underlättar studier av DDR dynamiken.
Introduction
Celler utsätts ständigt för endogena och exogena källor av DNA-skada som hotar deras genomisk integritet. DDR är en ensemble av signalering vägar att upptäcka, signal och reparera DNA skador för att upprätthålla genomet stabilitet. Vid DNA dubbelsträngat raster (DSBs), DDR uppstår främst på två kompletterande plattformar: γ-H2A.X-märkt kromatin och en opererande enkelsträngat DNA (ssDNA) region vanligtvis belagd med ssDNA-bindande komplexa RPA1,2.
UV-laser mikro-bestrålning av celler som redan sensibiliserats med den tymidin analoga 5-brom-2′ deoxiuridin (BrdU) eller bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA färgen skapar en blandning av DNA lesioner inklusive enkelsträngat raster) SSBs) och DSBs som framkalla en lokaliserad DDR på både kromatin och ssDNA plattformar3,4. Tidigare arbete visade att rekrytering av genomet underhåll faktorer dessa två distinkta plattformar på DSB kan diskrimineras använder energirika UV-A laser (335-365 nm) kombinerat med om2,5. Mikroskop utrustat med sådana lasrar är kostsamma eftersom de kräver en hög energi laser och dedikerad UV-A sändande mål vilket gör dem betydligt mindre utbredd i akademiska och farmaceutiska inställningar än laserskanning confocal Mikroskop med 405 nm laser linjerna. Studien av protein rekrytering och utbyte på mikro-bestrålade platser hindras också av den mödosamma manuell bildanalys som krävs för att beskriva dynamiska beteende av genomet underhåll faktorer.
Här visar vi att det före sensibilisering av celler med BrdU eller BBET nukleinsyra fläcken följt av mikro-bestrålning med en 405 nm laser på gemensamma confocal Mikroskop tillåter övervakning av genomet underhåll faktor dynamics på DNA lesioner. Med γ-H2A.X eller RPA komplexa subenheter som plattform markörer tillsammans med z-stapling för större skärpedjup och deconvolution för förbättrad upplösning tillåter försöksledaren att diskriminera faktorer som rekryteras lokalt att DSBs från dem som spridit sig till stora kromatin domäner kring första lesionen. Denna sub klassificering enligt olika transaktioner inom nukleär fack hjälper till att förfina de potentiella rollerna av uncharacterized proteiner som rekryteras till mikro-bestrålade platser. Dessutom, vi tillhandahåller bekväm protokoll och optimerad rörledningar för att snabbt analysera dynamiken i genomet underhåll faktorer med hjälp av den programvara med öppen källkod Fiji (en ImageJ distribution)6,7,8. Dessa förbättringar gällande micro-bestrålning metoder göra studiet av DDR möjligt i praktiskt taget alla laboratoriemiljö.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med metoderna som beskrivs ovan, tillåter 405 nm laser mikro-bestrålning av celler som redan sensibiliserats med BBET eller BrdU lokaliserade generering av DNA lesioner inklusive DSBs inom atomkärnor av vidhäftande mänskliga celler. Kinetiken av DDR på dessa DSBs liknar dem som skapas med andra metoder i eukaryota celler9,18,19. DSB resektion vid mikro-bestrålade platser leder till ssDNA-generation som kan följas med hj?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av de naturliga vetenskaperna och Engineering Research Council of Canada [Discovery grant 5026 till Arwidson] och av en Nästa Generation av forskare stipendium från Cancer Research Society [21531 till Arwidson]. Vi tacka Jean-François Lucier för att ge utmärkt kvalitetskontroll av Fiji Python skript och råd på statistisk analys. Vi tackar Dr. Stephanie A. Yazinski för om fixering lösning receptet. Vi tackar Paul-Ludovic Karsenti för hjälp med laser power mätningar.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Microirradiation Analysis Fiji Plugin. Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -. C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
