डीएनए घावों के लिए प्रोटीन भर्ती की जांच 405 एनएम लेजर माइक्रो-विकिरण का उपयोग
Summary
डीएनए क्षति मरंमत कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए परिभाषित उप परमाणु क्षेत्रों में घावों को प्रेरित करने के लिए एक प्रणाली की आवश्यकता है । हम स्थानीयकृत डबल-फंसे एक लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक 405 एनएम लेजर के साथ सुसज्जित और स्वचालित प्रक्रिया प्रदान करने के लिए इन घावों पर मरंमत कारकों की गतिशीलता को बढ़ाता है एक विधि का वर्णन ।
Abstract
डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (DDR) का पता लगाने के लिए प्रोटीन का एक बहुतायत का उपयोग करता है, संकेत, और डीएनए घावों की मरंमत । Delineating इस प्रतिक्रिया के जीनोम रखरखाव तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । भर्ती और घावों पर प्रोटीन के आदान प्रदान के बाद से अत्यधिक गतिशील हैं, उनके अध्ययन के लिए एक तेजी से और स्थानिक रूप से सीमांकित तरीके से डीएनए क्षति उत्पन्न करने की क्षमता की आवश्यकता है । यहाँ, हम स्थानीय रूप से एक 405 एनएम लेजर लाइन के साथ सुसज्जित एक सामान्य रूप से उपलब्ध लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मानव कोशिकाओं में डीएनए क्षति को प्रेरित करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन. लेजर धारियों में जीनोम रखरखाव कारकों का संचय इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है (यदि) या वास्तविक समय में फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ टैग प्रोटीन का उपयोग कर । प्रयोग phosphorylated हिस्टोन H2A । x (γ-H2A. x) और प्रतिकृति प्रोटीन A (RPA) मार्करों के रूप में, विधि उन है कि आसंन क्रोमेटिन पर फैल से स्थानीय स्तर पर भर्ती कारकों भेदभाव करने के लिए पर्याप्त संकल्प प्रदान करता है । हम आगे ImageJ प्रदान स्क्रिप्ट आधारित कुशलतापूर्वक डीएनए क्षति साइटों पर प्रोटीन reinformation के कैनेटीक्स की निगरानी । इन शोधन बहुत DDR गतिशीलता के अध्ययन को सरल बनाने ।
Introduction
कोशिकाएं लगातार डीएनए क्षति के अंतर्जात और exogenous सूत्रों को उजागर कर रही हैं जो उनकी जीनोमिक अखंडता को खतरा है । DDR संकेत है कि मार्ग का पता लगाने, संकेत है, और डीएनए घावों की मरंमत के जीनोम स्थिरता बनाए रखने के एक पहनावा है । पर डीएनए डबल-कतरा टूटता (DSBs), DDR दो पूरक प्लेटफार्मों पर मुख्य रूप से होता है: γ-H2A. X-लेबल क्रोमेटिन और एक rebinded एकल-असहाय डीएनए (ssDNA) क्षेत्र आम तौर पर ssDNA-बाध्यकारी जटिल RPA1,2के साथ लेपित ।
यूवी-लेजर कोशिकाओं के सूक्ष्म विकिरण thymidine एनालॉग 5-ब्रोमो-2’deoxyuridine (BrdU) या bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst ३३३४२) के साथ पूर्व-संवेदनशील डीएनए डाई एकल असहाय टूट सहित डीएनए घावों का एक मिश्रण बनाता है ( एसएसबी) और DSBs जो दोनों क्रोमेटिन और ssDNA प्लेटफार्मों3,4पर एक स्थानीयकृत DDR बटोरना । पिछले काम से पता चला है कि DSB में इन दो अलग प्लेटफार्मों के जीनोम रखरखाव कारकों की भर्ती उच्च ऊर्जा यूवी एक पराबैंगनीकिरण (335-365 एनएम) अगर2,5के साथ संयुक्त का उपयोग कर भेदभाव किया जा सकता है । ऐसे पराबैंगनीकिरण के साथ सुसज्जित सूक्ष्मदर्शी महंगा के रूप में वे एक उच्च ऊर्जा लेजर और समर्पित यूवी की आवश्यकता होती है-एक संचारण उंहें अब तक कम से शैक्षिक और दवा में प्रचलित बनाने के उद्देश्यों लेजर से-405 एनएम लेजर के साथ फोकल माइक्रोस्कोप स्कैनिंग लाइनों. माइक्रो-विकिरणित साइटों पर प्रोटीन भर्ती और विनिमय का अध्ययन भी जीनोम रखरखाव कारकों के गतिशील व्यवहार का वर्णन करने के लिए आवश्यक श्रमसाध्य मैनुअल छवि विश्लेषण द्वारा precluded है ।
यहां, हम बताते है कि पूर्व BrdU या BBET न्यूक्लिक एसिड के साथ कोशिकाओं के संवेदीकरण एक आम फोकल माइक्रोस्कोप पर एक 405 एनएम लेजर का उपयोग सूक्ष्म विकिरण द्वारा पीछा दाग डीएनए घावों पर जीनोम रखरखाव कारक गतिशीलता की निगरानी की अनुमति देता है । γ-H2A. X या RPA जटिल उपइकाई के रूप में एक साथ मंच मार्करों के रूप में z-स्टैकिंग के लिए क्षेत्र और deconvolution के बेहतर समाधान के लिए अधिक गहराई के लिए प्रयोग करने की अनुमति देता है कि स्थानीय रूप से उन है कि प्रसार से DSBs में भर्ती कर रहे है भेदभाव कारकों को आरंभिक घावों के आसपास के बड़े क्रोमेटिन डोमेन । विशिष्ट इंट्रा-न्यूक्लियर डिब्बों के अनुसार यह उप-वर्गीकरण माइक्रो-विकिरणित साइटों पर भर्ती किए गए विलक्षण प्रोटीन की संभावित भूमिकाओं को परिष्कृत करने में मदद करता है । इसके अलावा, हम सुविधाजनक प्रोटोकॉल और अनुकूलित पाइपलाइनों प्रदान करने के लिए तेजी से जीनोम रखरखाव खुले स्रोत सॉफ्टवेयर फिजी (एक ImageJ वितरण)6,7,8का उपयोग कर कारकों की गतिशीलता का विश्लेषण । वर्तमान सूक्ष्म विकिरण तरीकों के लिए इन शोधन वस्तुतः किसी भी प्रयोगशाला की स्थापना में संभव DDR के अध्ययन प्रदान करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर उल्लिखित विधियों का उपयोग करना, 405 एनएम लेजर कोशिकाओं के सूक्ष्म विकिरण पूर्व BBET या BrdU के साथ संवेदनशील अनुयाई मानव कोशिकाओं के नाभिक के भीतर DSBs सहित डीएनए घावों की स्थानीयकृत पीढ़ी की अनुमति देता है ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद कनाडा के द्वारा समर्थित किया गया था [डिस्कवरी अनुदान ५०२६ करने के लिए एक. m] और द्वारा एक अगली पीढ़ी के वैज्ञानिकों छात्रवृत्ति कैंसर रिसर्च सोसाइटी से [२१५३१ a. m करने के लिए]. हम धंयवाद जीन फ़्रांस्वा Lucier फिजी पायथन लिपियों और सांख्यिकीय विश्लेषण पर सलाह के उत्कृष्ट गुणवत्ता नियंत्रण प्रदान करने के लिए । यदि निर्धारण समाधान नुस्खा के लिए हम Dr. स्टेफ़नी A. Yazinski का धन्यवाद करते हैं । हम लेजर पावर माप के साथ मदद के लिए पॉल लुडोविक Karsenti धन्यवाद ।
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
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