단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사
Summary
DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
DNA 손상 응답 (DDR) 사용 하 여 단백질의 과다 검출, 신호, 및 DNA 장애 복구. 이 응답을 묘사 하는 것이 게놈 유지 관리 메커니즘을 이해 중요 합니다. 모집 및 병 변에서 단백질의 교류는 매우 동적, 이후 자신의 연구 신속 하 고 공간 구분 방식으로 DNA 손상을 생성 하는 기능을 필요 합니다. 여기, 우리는 로컬로 사용 하 여 일반적으로 사용 가능한 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 라인을 갖춘 인간 세포에 DNA 손상을 유도 하는 절차를 설명 합니다. 레이저 줄무늬에서 면역 형광 검사 (IF) 또는 실시간으로 평가 될 수 있다 게놈 정비의 축적 단백질 형광 기자와 태그를 사용 합니다. Phosphorylated 히스톤 H2A를 사용 하 여. (Γ-H2A.X) X 복제 단백질 A (RPA) 표식, 메서드를 인접 chromatin에서 확산에서 로컬로 보충 요인 차별을 충분 한 해상도 제공 합니다. 우리는 더 효율적으로 DNA에서 단백질 relocalization의 활동을 모니터링에 ImageJ 기반 스크립트 손상 사이트 제공 합니다. 이러한 상세는 크게 DDR 역학의 연구를 단순화합니다.
Introduction
세포는 DNA 손상의 그들의 게놈 무결성을 위협 하는 내 인 성 및 외 인 소스에 지속적으로 노출 됩니다. DDR 신호 경로 검색 하 고, 신호, DNA 게놈 안정성을 유지 하기 위해 장애 복구의 앙상블입니다. DNA 이중 가닥 틈 (DSBs), DDR 2 무료 플랫폼에서 주로 발생: γ-H2A.X 라는 chromatin와 일반적으로 ssDNA 묶는 복잡 한 RPA1,2코팅 절제 단일 가닥 DNA (ssDNA) 지역.
UV 레이저 마이크로-방사선 사전 티 미 딘 아날로그 5-브로 모-2′ deoxyuridine (BrdU) 또는 bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA 염료 감 응 전지의 단일 가닥 나누기 (를 포함 하 여 DNA 변의 혼합물을 만듭니다. SSBs) 및 DSBs chromatin와 ssDNA 플랫폼3,4에 지역화 된 DDR 유도 하. 이전 작품 모집 게놈 DSB에서 이러한 두 가지 플랫폼을 유지 보수 요인의 고 에너지 자외선 레이저 (335-365 nm) 경우2,5와 결합을 사용 하 여 차별 수 있습니다 보여주었다. 높은 에너지 레이저와 전용된 UV-A 전송 목적 405 nm 레이저 confocal 현미경 레이저 스캔 보다 훨씬 덜 학문과 제약 설정에 널리 그들을 만드는 필요한 현미경 같은 레이저 장비는 비용이 많이 드는 라인입니다. 단백질 모집 및 마이크로 반구 사이트에서 exchange의 연구는 또한 게놈 유지 보수 요인의 동적 동작을 설명 하는 데 필요한 힘 드는 수동 이미지 분석에 의해 배제 됩니다.
여기, 우리가 BrdU 또는 BBET 핵 산 얼룩과 셀의 사전 sensitization 마이크로 방사선 일반적인 confocal 현미경에 405 nm 레이저 수 게놈 DNA 병 변에서 유지 보수 요소 역학의 모니터링을 사용 하 여 다음을 보여줍니다. 향상 된 해상도 대 한 필드와 deconvolution의 큰 깊이 z 스태킹 함께 플랫폼 마커로 γ-H2A.X 또는 RPA 복잡 한 소 단위를 사용 하면 차별 요소는 로컬로 채용 DSBs 그 확산 실험 초기 병 변 주변 대형 chromatin 도메인입니다. 명료한 내 핵 구획에 따라 하위이 분류 마이크로 반구 사이트에 보충 하는 새롭거나 단백질의 잠재적인 역할을 수정 하는 데 도움이 됩니다. 또한, 편리한 프로토콜을 제공 하며 빠르게 오픈-소스 소프트웨어 피지 (ImageJ 배포)6,,78을 사용 하 여 게놈 유지 보수 요인의 역학을 분석 하는 파이프라인 최적화. 현재 마이크로 조사 방법에이 수정이 가능한 거의 모든 실험실 설정에서 DDR의 연구를 렌더링합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위에서 설명한 방법을 사용 하 여, 405 nm 레이저 마이크로-방사선 사전 BBET 또는 BrdU 응 셀의는 DSBs를 포함 하 여 부착 인간 세포의 핵 내 DNA 변의 지역화 된 세대 수 있습니다. 이러한 DSBs에서 DDR의 활동은 진 핵 세포9,,1819에 다른 방법으로 생성 된 비슷합니다. 마이크로 반구 사이트에서 DSB 절제 리드 ssDNA 세대 RPA32를 대상으로 항…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 캐나다의 [검색 부여 5026 오전]와 암 연구 학회 [오전에 21531]에서 과학자 장학금의 다음 세대에 의해 지원 되었다. 장-프랑수아 Lucier는 통계 분석에 피지 파이썬 스크립트 및 조언의 우수한 품질 관리를 제공 하는 감사 합니다. 우리는 경우 고정 솔루션 제조 법에 대 한 박사 스테파니 A. Yazinski 감사합니다. 우리는 레이저 전력 측정에 대 한 폴 뤼도 Karsenti를 감사합니다.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
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