Studere DNA skade reparasjon kinetics krever et system å indusere lesjoner på definerte sub kjernefysiske regioner. Vi beskriver en metode for å opprette lokaliserte double-strandet bryter med laser-skanning AC confocal mikroskop utstyrt med en 405 nm laser og gi automatisert prosedyrer for å kvantifisere dynamikken i reparasjon faktorer på disse lesjoner.
DNA skade svar (DDR) bruker en mengde proteiner å oppdage signal og reparere DNA lesjoner. Skildre dette svaret er avgjørende å forstå genomet vedlikehold mekanismer. Siden rekruttering og utveksling av proteiner på lesjonene er svært dynamisk, krever studiet muligheten til å generere DNA skade på en rask og romlig tabulatordelte måte. Her beskriver vi fremgangsmåtene for å indusere lokalt DNA skade i menneskelige celler ved hjelp av et vanlig laserskanning AC confocal mikroskop utstyrt med en 405 nm laser linje. Akkumulering av genomet vedlikehold faktorene laser striper kan vurderes ved immunofluorescence (hvis) eller i sanntid med proteiner merket med fluorescerende journalister. Bruke fosforylert histone H2A. X (γ-H2A.X) og replikering Protein A (RPA) som markører, metoden gir tilstrekkelig oppløsning til å diskriminere lokalt rekruttert faktorer fra de som spredt på tilstøtende chromatin. Videre tilbyr vi ImageJ-baserte skript effektivt overvåke the kinetics av protein relocalization på DNA skade områder. Disse forbedringer forenkle studiet av dynamikken DDR.
Celler blir stadig utsatt for endogene og eksogene kilder til DNA skade som truer deres genomisk integritet. DDR er et ensemble av signalnettverk trasé som oppdage signal og reparere DNA lesjoner å opprettholde genomet stabilitet. DNA double-strandet pauser (DSBs), DDR oppstår hovedsakelig på to utfyllende plattformer: γ-H2A.X-merket chromatin og en resected single-strandet DNA (ssDNA) region vanligvis belagt med ssDNA-binding komplekse RPA1,2.
UV-laser mikro-bestråling av celler pre sensibilisert med thymidine analoge 5-bromo-2′ deoxyuridine (BrdU) eller bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA fargestoff skaper en blanding av DNA lesjoner inkludert single-strandet pauser ( SSBs) og DSBs som lokke fram en lokalisert DDR på både chromatin og ssDNA plattformer3,4. Tidligere arbeid viste at rekruttering genomet vedlikehold faktorer til disse to forskjellige plattformer på DSB kan bli diskriminert med høy energi UV-A lasere (335-365 nm) kombinert med Hvis2,5. Mikroskop utstyrt med slike lasere er kostbare som de krever en høy energi laser og dedikert UV-A overfører mål gjør dem langt mindre utbredt i akademiske og farmasøytiske enn laser-skanning AC confocal mikroskop med 405 nm laser linjer. Studiet av protein rekruttering og utveksling på mikro-bestrålt nettsteder er også utelukket av arbeidskrevende manuell bildeanalyse må beskrive den dynamiske oppførselen av genomet vedlikehold faktorer.
Her viser vi at den pre sensibilisering av celler med BrdU eller BBET nukleinsyre flekken etterfulgt av mikro-bestråling bruke en 405 nm laser på vanlige AC confocal mikroskop lar overvåking av genomet vedlikehold faktor dynamics på DNA lesjoner. Bruke γ-H2A.X eller RPA sammensatte underenheter som plattform markører sammen med z-stabling for større dybdeskarphet og deconvolution for forbedret oppløsning lar eksperimentator å diskriminere faktorer som rekrutteres lokalt til DSBs fra de som spres til store chromatin domener rundt den første leksjonen. Denne sub klassifisering i henhold til forskjellige intra kjernefysiske rom bidrar til å begrense potensielle rollene uncharacterized proteiner rekruttert til mikro-bestrålt nettsteder. Dessuten, vi tilbyr praktisk protokoller og optimalisert rørledninger for å raskt analysere dynamikken i genomet vedlikehold faktorer bruker åpen kilde-programvare Fiji (en ImageJ distribusjon)6,7,8. Disse avgrensninger til gjeldende mikro-bestråling metoder gjengi studiet av DDR i nesten enhver laboratorium setting.
Ved hjelp av metodene beskrevet ovenfor, kan 405 nm laser mikro-bestråling av celler pre sensibilisert med BBET eller BrdU lokalisert generering av DNA lesjoner inkludert DSBs innen kjerner i tilhenger menneskelige celler. Kinetics DDR på disse DSBs er lik de generert med andre metoder i eukaryote celler9,18,19. DSB reseksjon på mikro-bestrålt områder fører til ssDNA generasjon som kan følges med et RPA32 målretting anti…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av naturvitenskap og Engineering Forskningsrådet Canada [Discovery grant 5026 til am] og en neste generasjon av forskere stipend fra Cancer Research Society [21531 til am]. Vi takker Jean-François Lucier for å gi utmerket kvalitetskontroll av Fiji Python-skript og råd om statistisk analyse. Vi takker Dr. Stephanie A. Yazinski for hvis fiksering løsning oppskriften. Vi takker Paul-Ludovic Karsenti for hjelp med laser makt mål.
Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
Sucrose | BioShop | SUC507 | |
JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |