Här presenterar vi ett protokoll för att beskriva utveckling och validering av en enda molekyl array digital ELISA-testet, vilket gör den ultra känslig detektion av alla IFN-α undertyper i mänskliga prover.
Huvudsyftet med detta protokoll är att beskriva utveckling och validering av en interferon (IFN)-α enda molekyl array digital enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) analys. Detta system möjliggör kvantifiering av humant IFN-α protein med oöverträffad känslighet och ingen korsreaktivitet för andra arter av IFN.
Det första viktiga steget i protokollet är valet av antikropp paret, följt av konjugationen av capture antikropp till paramagnetiska pärlor och biotinylation hos en detektionsantikropp. Efter detta steg, kan olika parametrar såsom assay konfiguration, detektor antikroppskoncentrationen och buffert sammansättning ändras tills optimal känslighet uppnås. Slutligen, specificitet och metodens reproducerbarhet bedöms för att säkerställa förtroendet för resultaten. Här utvecklade vi ett IFN-α enda molekyl array test med en detektionsgräns på 0,69 fg/mL med hög affinitet autoantikroppar isolerade från patienter med biallelic mutationer i proteinet autoimmuna regulator (AIRE) orsakar autoimmuna polyendocrinopathy syndrom typ 1/autoimmuna polyendocrinopathy-candidiasis-ektodermala dystrofi (APS1/APECED). Ännu viktigare, aktiverat dessa antikroppar upptäckt av alla 13 undertyper för IFN-α.
Denna nya metod tillåter detektering och kvantifiering av IFN-α protein i mänskliga biologiska prover vid attomolar koncentrationer för första gången. Ett sådant verktyg kommer att vara mycket användbart i övervakningen av denna cytokin i hälso- och sjukdomstillstånd, de flesta särskilt infektioner, autoimmunitet och autoinflammation.
Typ jag behandlats är en familj av cytokiner som spelar en central roll i iscensättandet antivirala immunsvar. De upptäcktes först av Isaacs och Lindenmann 60 år sedan1,2 och det är nu känt att denna heterogen familj av polypeptider består av 14 olika underklasser (13 IFN-α subtyper och 1 IFN-β). Typ jag behandlats är väsentliga för clearance av virusinfektioner, men har också varit inblandade i en mängd mänskliga sjukdomstillstånd, inklusive autoimmuna sjukdomar systemisk lupus erythematosus (SLE), juvenil dermatomyosit (JDM), patologi och typ Jag interferonopathies i vilken konstituerande typen IFN-inducerad signalering resultaten i patologi3,4,5,6,7.
Studera typ I IFN protein nivåer i biologiska prover har varit utmanande sedan dess inledande identifiering som en ”störande ämne”1,2. Sandwich enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) är för närvarande den mest använda metoden för påvisande av IFN-α protein. Trots att specifika, enkel och snabb, typ I IFN ELISAs närvarande viktiga begränsningar, såsom begränsad känslighet. Dessutom, kräver mätning av alla IFN-α subtyper användning av flera analyser varje med sin egen upptäckt kapacitet och känslighet. Medan det finns kommersiella ELISA-test som upptäcker olika subtyper av IFN-α, deras känslighet är begränsad (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL och 12,5 pg/mL, respektive) som ofta är otillräcklig för att upptäcka IFN-α protein i biologiska prover. För att kringgå den här begränsningen av flera biologiska proxy analyser har utvecklats för att kvantifiera typ I IFN genom att mäta inducerade genuttryck eller funktionell aktivitet8,9,10,11, 12 , 13 , 14. dessa analyser ger dock inte en direkt mätning av proteinet IFN-α.
I denna studie användes enda molekyl med digital array ELISA-teknik för att utveckla ett test för påvisande av enstaka IFN-α proteinmolekyler. Digitala ELISA använder samma grundläggande kemi som konventionella ELISA, dock reaktionen sker i matriser bestående av 50 000 enskilda 46 femtoliter storlek brunnar15,16. Enda proteinmolekyler fångas av antikroppsbelagda paramagnetiska pärlor och märkt med en biotinylerade detektionsantikropp, följt av bindningen av ett enzymkonjugat, streptividin-β-galaktosidas (SBG). Därefter, är pärlorna upphängda med ett fluorogenic enzym substrat, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), till singel-molekyl arrayer. Genom att minska volymen reaktion 2 miljarder gånger17, en hög lokal koncentration av fluorescerande signal uppnås och enda molekyl räknas blir möjligt, eftersom varje molekyl skapar en signal som nu kan tillförlitligt mätt18. I huvudsak kan enda molekyl matriser räkna enda immunocomplexes och att bestämma ett genomsnittligt antal enzymer per pärla (AEB). Räkna mikrobrunnarna där en signal detekteras tillåter kvantifiering/digitalisering av proteinmolekyler, som det finns en direkt korrelation mellan proteinkoncentration och förhållandet mellan immunocomplexed-pärlor och en totala antalet pärlor i femtoliter-stora kamrarna.
Yeung et al. utfört en omfattande plattformsoberoende utvärderingsstudie med nio olika tekniker och fyra cytokin immunanalyser med syftet att jämföra precision analys, känslighet och data korrelation över olika plattformar19. En av de viktigaste resultaten av studien var att enda molekyl matriser och enda molekyl räknar immunoassay presenteras högsta känsligheten för upptäckt av cytokiner i humant serum inom intervallet sub-pg/mL koncentration. Enda molekyl array digital ELISA cytokin-analyser har använts för att studera rollen av TNF-α och IL-6 i Crohns sjukdom20, IFN-α i interferonopathy och autoimmuna patienter 7, och de olika post-translationally modifierade former av C-X-C motiv chemokine 10 (CXCL10) i kronisk hepatit och friska donatorer som fick sitagliptin21,22. Andra program omfatta mätning av rhodopsin i patienter med diabetesretinopati23; studien av hjärnan patologier genom serum/plasma mätningar av neurofilament light24 och amyloid-β 1-42 peptid25, i samband med multipel skleros och Alzheimers sjukdom, respektive. Enda molekyl array-analyser kan också användas för upptäckt av förbättrad patogen såsom karakterisering av HIV viral reservoar26, och även för upptäckt av DNA27 och micro RNAs28. En stor fördel med den enda molekyl array-tekniken är denna hög flexibilitet, då ett test mot någon analyt sevärdheter kan utvecklas om en specifik antikropp-paret finns. Dessutom är homebrew assay kit kommersiellt tillgängliga, så att utvecklingen av nya analyser, protokollet som är detaljerad i modifierad form nedan.
Här, presenteras en detaljerad beskrivning av utveckling och validering stegen för en enda molekyl array analys som resulterar i förbättrad känslighet för IFN-α protein upptäckt. Antikroppar för enda molekyl array analyser bör vara högspecifik, undvika arg reactivity med relaterade proteiner (med arter specificitet beaktas om det är relevant). Antikroppar med en KD mindre än 10-9 M bör helst väljas; hög affinitet säkerställer starka bindning, med produktionen av en högre signal. Kineticsen av antikropp-antigen bindningen är också viktiga och snabb Kpå och långsam Koff kommer att gynna antigen-antikropp komplexa församling. Börjar med en antikropp-par som har en bra prestanda i klassiskt ELISA, med en detektionsgräns (LOD) 1-100 pg/ml, ökar chanserna att få en mycket känslig enda molekyl array analys. Chang och kollegor utfört detaljerad kinetiska studier av biomolekylära interaktioner inträffar vid varje steg, föreslår en uppsättning ekvationer att förutsäga Analytisk känslighet18. De visade den enda molekyl arrayen digital ELISA verkar vara effektiv inom ett brett spektrum av antikropp tillhörighet (KD ~ 1011 – 10−9 M) as well as det signal generationen är mer beroende av den-andelen sådana antikroppar.
För att utnyttja hög affinitet typ antikroppar tog vi fördel av antikroppar isolerade från patienter med autoimmuna polyendocrinopathy syndromet 1/autoimmuna polyendocrinopathy-candidiasis-ektodermala dystrofi (APS1/APECED)29. Av skäl som ännu inte har förstått, den stora majoriteten av AIRE-brist individer utveckla en grunduppsättning av hög-aviditet antikroppar mot alla IFN-α subtyper29och vi valt två mot IFN-α-antikropp kloner av kompletterande bindande samhörighet för de olika subtyperna, IFN-α, som uppskattade av IC50 värden. Kombinationen av dessa unika hög affinitet antikroppar med enda molekyl array-teknik aktiverad direkt kvantifiering av IFN-α vid attomolar (fg/mL) koncentrationer. Sådana ultrasensitive IFN-α protein upptäckt kommer att bidra till en bättre förståelse av naturen, förordning och biologiska effekter av IFN-inducerad svar i olika sjukdomen inställningar.
Vi beskrivs häri, utveckling och validering av en mycket reproducerbara, ultrasensitive enda molekyl array digital ELISA för direkt kvantifiering av IFN-α protein i mänskliga prover (steg sammanfattas i tabell 1). En av de viktigaste stegen i utvecklingen av analysen är valet av antikropp par16, med egenskaper när det gäller kinetik och epitop bindande nyckeln till en framgångsrik analys. Det är viktigt att undvika användning av Parade monoklonala antikroppar som riktar den samma epitop eller som orsaka sterisk hinder. Polyklonala antikroppar kan användas som identifiering antikroppar för att övervinna sådana begränsningar. Vid varje given steg uppnås inte önskad känslighet, bör ytterligare optimeringsmöjligheter övervägas. Detta kan inkludera användning av alternativa antikropp par, förändringar i parametrar såsom protein typ (t.ex. BSA < kasein), pH (6.0-8,5), jonstyrka, buffertkapacitet (e.g. NaCl och fosfat koncentrationer), bärare pärlor eller förekomsten av tensider. Ett brett utbud av parametrar optimeras con när du utvecklar en enda molekyl array analys. Dock sammantaget förhållanden som ger hög signal: bakgrunden nyckeltal och minimal LODs är de program (se figur 1, figur 2och figur 3).
När det gäller specificitet, IFN-α analysen visade ingen arg reactivity för eventuella andra behandlats testade (β, γ, λ1, λ2, ω) (figur 4a) och var i stånd att upptäcka alla 13 IFN-α subtyper (figur 4b). Analysen visade dock en lägre affinitet för IFN-α2 subtyp, (figur 4b och kompletterande Tabell4). Intressant, observerades olika känslighet för olika klasser av IFN-α2 (a, b, c) också, vilket kan bero på olika framställningsmetoder eller olika aminosyresekvenser, som de IFN-α2 subtyperna erhölls från olika kommersiella leverantörer. Med detta som enda undantag gav alla IFN-α arter mycket liknande svar. Analysens specificitet visades ytterligare av förbehandling av prov med den mot IFN-α en klon, som upphävts signalen (figur 6 och kompletterande Tabell6).
En av de främsta fördelarna med denna teknik är att någon analyt sevärdheter kan potentiellt riktade16. Dessutom kan olika biologiska prov testas, som serum, plasma, cerebrospinalvätska, cellulär lysates, kultur supernatanterna31 och även andetag32. Vanligtvis, utförs en 1:3 utspädning av plasma för att undvika potentiella igensättning av den enda molekyl array analyzer. Dock analyten av intresse kunde närvara vid mycket låga koncentrationer i de relevanta biologiska provet och högre koncentrationer av prov kan vara obligatoriska (beroende på analysens känslighet)33. Även om det finns potential för multiplexing bibehållen bra känslighet34, är det en mer utmanande process och analyser för att mäta större än 6 proteiner inom samma experimenten har ändå till vara framkallade35.
Förmågan att upptäcka och kvantifiera cytokiner och andra biologiska relevanta proteiner vid sådana låga koncentrationer öppnar upp en helt ny rad applikationer33,36. Det är väl känt att många proteiner utövar sina effekter även vid mycket låga koncentrationer, som hittills låg under detektionsgränsen för de bästa ELISAs37. Medan andra immunoassay tekniker erbjuder fördelar jämfört med konventionella ELISA19, visar vi här att enda molekyl array digital ELISA är en reproducerbar och robust plattform för ultrasensitive upptäckt av låg koncentration cytokiner i mänskliga prover. Denna teknik erbjuder enorma möjligheter för biomarkör identifiering och förbättrade patientens hantering av ett brett spektrum av sjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
DD och YJC erkänner stöd från ANR (projekt IFNX, ingen. CE17001002) och ImmunoQure AG för att tillhandahålla monoklonala antikroppar. Vi tackar Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki och Pierre Quartier för att tillhandahålla kliniska prover. YJC erkänner Europeiska forskningsrådet (GA 309449: gemenskap till YJC), och ett statsbidrag som förvaltas av National Research Agency (Frankrike) enligt programmet ”investeringar för framtiden” med referensnummer ANR-10-IAHU-01.
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) | ImmunoQure AG | NA | Not commercially available |
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone | eBioscience | BMS216C | |
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone | eBioscience | BMS216BK | Not an ELISA kit but bulk abs |
IFN α2c | eBioscience | BMS305 | OK |
IFN αI (17) | PBL | 11150-1 | |
IFN α2a | PBL | 11100-1 | |
IFN α2a | PeproTech | No longer available | |
IFN α2b | PBL | 11105-1 | |
IFN α1 | PBL | 11175-1 | |
IFN α4a (M1) | PBL | 11177-1 | |
IFN α4b (a4) | PBL | 11180-1 | |
IFN αB2 (a8) | PBL | 11115-1 | |
IFN αC (a10) | PBL | 11120-1 | |
IFN αD (a1) | PBL | 11125-1 | |
IFN αG (a5) | PBL | 11135-1 | |
IFN αF (a21) | PBL | 11130-1 | |
IFN αH2 (a14) | PBL | 11145-1 | |
IFN αJ1 (a7) | PBL | 11160-1 | |
IFN αK (a6) | PBL | 11165-1 | |
IFN αWA (a16) | PBL | 11190-1 | |
IFN λ1 | PeproTech | 300-02L | |
IFN λ2 | PeproTech | 300-02K | |
IFN ω | PeproTech | 300-02J | |
IFN β | PeproTech | 300-02BC | |
IFN γ | PeproTech | 300-02 | |
Anti-IFN-α ELISA | PBL | 41115.1 | |
96-well plates | Corning | 3904 | |
ISRE-Reporter | Qiagen | CCS-008L | |
Fu-GENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem | ThermoFischer Scientific | 31985062 | |
Dual-Luciferase Reporter assay | Promega | E1910 | |
Nonidet P40 Substitute | Sigma-Aldrich | 74385 | |
Spectrophotometer NanoDrop 1000 | Thermo Scientific | No longer available | |
Amicon micocentrifuge tubes – 0.5mL filtres | Merck Millipore | UFC505096 | |
Bead Conjugation Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
Non-Encoded Paramagnetic Beads | Quanterix | 101360 | |
Bead Wash Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
EDC | Fisher Scientific | 11844071 | |
Bead Blocking Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
Bead Diluent Buffer | Quanterix | 101362 | |
Detector and Sample Diluent | Quanterix | 101359 | |
Biotinylation Reaction Buffer | Quanterix | 102040 | Can not be ordered separately |
NHS-PEG4-Biotin | Fisher Scientific | 11891195 | |
diH2O | |||
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) | Thermo Scientific | 75002478 | |
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) | IKA | MS2 | |
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) | Thermo Scientific | ||
1.7mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | ||
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) | VWR | 521-2844 | |
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) | Eppendorf | ||
Single molecule array (Simoa) reagents | |||
SBG, Bead and Detector Barcode Labels | Quanterix | 101652 | |
15 mL Reagent Bottles | Quanterix | 102411 | |
Simoa specimen 96-well plates | Quanterix | 101457 | |
Simoa Discs | Quanterix | 100001 | |
Simoa 2.0 conductive Tips | Quanterix | 101726 | |
Simoa Cuvettes | Quanterix | 100803 | |
Simoa SBG Reagent | Quanterix | 102295 | |
Simoa RGP Reagent | Quanterix | 101736 | |
Simoa System Buffer 1 | Quanterix | 100486 | |
Simoa System Buffer 2 | Quanterix | 100487 | |
Sealing Oil | Quanterix | 100206 | |
ddH2O | |||
Simoa HD-1 Analyzer | Quanterix | 100032 | |
Technologies | |||
Single molecule array (Simoa) | Quanterix | ||
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems | Singluex |