Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem
Summary
Bu iletişim kuralı fizyolojik ve diğer biyolojik araştırmaları için yararlıdır zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri hazırlama yöntemi açıklanır.
Abstract
Gardiyan hücreleri belirli katkıları bitkilerin genel işlevi için bu hücre tür bilgi için önemli bir çalışmadır. Ancak, genellikle izole etmek zordur ve böylece kez üstlerinde bir meydan okuma sağlar.
Bu çalışmada stomatal guard hücre zenginleştirme yöntemi oluşturur. Protokol bant koruma hücreleri izole ve proteinler hücrelerden ayıklamak için kullanır. Bu yöntem sırasında yalıtım bütünlüğü ve muhafız hücre verimini artırır ve hücre sinyal gönderme süreçleri ve nasıl onlar için stomatal hareketi fenotipleri ilişkilendirmek için güvenilir bir örnek sağlar. Bu yöntemde, bitki yaprakları teyp iki bölümleri arasında bölümlenmiş ve ayrı abaxial yan kaldırmak için soyulmuş. Bu iletişim kuralı Arabidopsis yaprak dokusu ile nöbetçi hücreleri izole etmek için uygulandı. Hücreleri Absisik asit (ABA) stoma bantlı hareketi yanıt ABA olarak değerlendirmek için ile floresein diacetate canlılığı belirlemek için (FDA) ile tedavi edildi. Sonuç olarak, bu iletişim kuralını zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri hazırlama ve protein izole için yararlı olmaktadır. Hücreleri ve protein kalitesini burada etkinleştir fizyolojik ve biyolojik diğer çalışmalar elde.
Introduction
Stoma bantlı Genel Fizyoloji ve fitness bitkilerin önemli bir rol oynamaktadır. Bu küçük bitki belirli yapılara guard hücreler olarak bilinen iki özel epidermal hücre tarafından kurulur ve en bol yaprakları abaxial yüzeyinde bulunur. Stoma bantlı gazlar terleme ile su kaybı kontrolünü yanı sıra bitki ve atmosfer arasındaki alışverişi için gereklidir. Gardiyan hücreleri düzenleyen stoma bantlı diyafram farklı dış (Örneğin, ışık, nem, patojen iletişim, karbondioksit düzeyleri) tümleştirme yoluyla ve iç (Örn., endojen hormonlar) uyaranlara1,2. Son 20 yıl içinde bu hücre tipi eğitim hücre süreçleri bitkilerde sinyal için bir model sistemi haline gelmiştir. Bu hücreler bir yaprak toplam hücrelerde küçük bir kısmını oluşturur; Böylece, kendi benzersiz cep araştırmak için biyokimyasal ve moleküler özelliklerini bir tek hücreli şekilde bu diğer yaprak hücre türlerinden yalıtmak gereklidir. Geçmişte, guard hücre çalışmaları bu hazırlık guard hücre önceki (GCP)3,4,5kez işe. Bu genellikle hücre duvarı aşağılayıcı enzimler ve/veya karıştırma ile mekanik kesintileri büyük miktarda kullanımı gerektirir ve genellikle GCP örnek kez hazırlamak için saatlerce sürer gibi pahalı ve zaman alıcı olması ile küçük verim kez kanıtlamıştır. Daha da önemlisi, çünkü gardiyan hücreleri stoma bantlı diyafram düzenleyen tam çiftleri olarak hareket, GCP kullanımı guard hücre sinyallemesi eğitimi için yapay bir sistem olarak görülebilir.
Burada, sağlam koruma hücreleri zenginleştirilmiş ve fizyolojik yanıt uyaranlara karşı korumak stoma bantlı hazırlamak için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem mesophyll hücre önceki6,7ayırmak için kullanılan bir yöntem tarafından ilham kaynağı oldu. Bizim Yöntem, stoma bantlı ilk mesophyll hücreleri çoğunluğu ayırmak için bant kaldırım ve nöbetçi hücreleri içeren abaxial katmandan yaprak adaxial katmana bağlı NET kullanılarak hazırlanır. Bu bant yaprak her tarafına bir parçası yapıştırılması ve onları ayrı peeling yapılır. Abaxial katman hücrelerden stoma bantlı-açılış arabellekte ışık altında kurtarmak için izin verilir. Daha sonra kalan kaldırım hücreleri hücre duvarı enzimler, kasette zenginleştirilmiş guard hücre bırakarak aşağılayıcı küçük bir miktar kullanarak kaldırılır.
Basit bu yöntemde, uygun ve duyarlı stomatal gardiyan hücreleri hızlı ve verimli bir şekilde 50 kabukları minimum maliyet ile zenginleştirilmiş stomatal gardiyan hücreleri almak için bir saat almaya hazır olun. İşte Yöntem bitki hücreleri için önceki nerede hazırlanan önceki yöntemlerine göre daha az zarar getirir. Buna ek olarak, malzeme bu yöntem verim arzu protein tutarlardan toplanan. En önemlisi, yaprak karıştırma için tabi tutulur değil veya uzun Sindirim süreleri ve nöbetçi hücreleri korunacak çünkü, çalışmaların sonuçları daha yakından bir muhafız hücrenin doğal biyoloji ilgili olacak. Bu yöntemle, stomatal hareketleri gerçek zamanlı olarak moleküler seviyede değişikliklerle ilişkili olabilir. Böylece, bu hazırlık yöntemi kullanarak çalışmalardan elde bilgi koruma hücre sinyallemesi daha kapsamlı bir anlayış için önemli olacaktır.
Bitki Arabidopsis thaliana bir model olarak kullanılan; Ancak bu iletişim kuralı stomatal guard hücrelerinde diğer bitki türleri Brassica napus gibi küçük değişiklikler ile zenginleştirme sindirim zaman uygulanabilir. Kavramının bir kanıtı olarak stomatal gardiyan hücreleri bu yöntemle zenginleştirilmiş uygun ve floresein diacetate (FDA) tahlil ve bitki hormon Absisik asit (ABA), sırasıyla kullanan çalışmalar tarafından gösterildiği gibi uyaranlara karşı duyarlı olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, yüksek kaliteli protein bu bekçi hücrelerden ayrılmış olabilir göstermiştir. Burada, bu sürecin detaylı bir protokol açıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gardiyan hücreleri sinyal iletim mekanizmaları tesislerinde çalışmak için bir model sistem ve çalışmada kullanılan örnekleri hazırlanması Biyolojik sorulara cevap için en uygun olduğundan emin olmak önemlidir. Gardiyan hücreleri bitki araştırma topluluğu içinde artan ilgi rağmen nasıl stomatal hareketi ve Fizyoloji sağlayacak stomatal gardiyan hücreleri hazırlamak için evrensel bir yöntem yoktur işte birinde incelenecektir için moleküler değişikliklerinin yanı sıra sistem. Onları ayır…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Daniel Chen üzerinden Dijital Video üretim ekibi, Buchholz lise video düzenleme konusunda yardım almak için teşekkür ederiz. Bu araştırma stomatal gardiyan hücreleri, proteomik ve metabolomics Chen laboratuarında hibe bize Ulusal Bilim Vakfı (0818051, 1158000 ve 1412547) tarafından desteklenmiştir. Wenwen Kong Çin burs Konseyi tarafından desteklenir. Dr. Qiuying Pang Çin burs Konseyi ve Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31570396) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
- Acharya, B., Assmann, S. Hormone interactions in stomatal function. Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).
- Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. Guard cell signal transduction. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).
- Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses. Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).
- Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts. New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).
- Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).
- Wu, F. H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich – a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 10 (2009).
- Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues. Frontiers in Plant Science. 6, (2015).
- Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Agnew, B., Murray, D., Patton, W. A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents. Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895). Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
