Stomates Tape-Peel : Une méthode améliorée pour la préparation d’échantillons de cellules de garde
Summary
Ce protocole décrit une méthode de préparation des cellules de garde des stomates enrichis qui est utile pour des études biologiques physiologiques et autres.
Abstract
L’étude des cellules stomatiques est essentiel à la connaissance des apports spécifiques de ce type de cellule à la fonction globale de plantes. Toutefois, il est souvent difficile d’isoler, et donc les étudier souvent fournit un défi.
Cette étude établit une méthode d’enrichissement stomatique cellules de garde. Le protocole utilise le ruban Scotch pour isoler les cellules stomatiques et extraire des protéines des cellules. Cette méthode améliore l’intégrité et le rendement des cellules de garde lors de l’isolation et fournit un échantillon fiable pour l’étude des processus de signalisation cellulaire et comment elles sont corrélées aux phénotypes mouvement stomatique. Dans cette méthode, les feuilles de la plante ont été partitionnés entre deux portions de la bande et pelées part pour retirer la face abaxiale. Ce protocole a été appliqué aux tissus foliaires Arabidopsis pour isoler les cellules stomatiques. Les cellules ont été traitées avec la fluorescéine diacétate (FDA) pour déterminer la viabilité et l’acide abscissique (ABA) pour évaluer le mouvement des stomates en réponse à ABA. En conclusion, le présent Protocole s’avère utile pour la préparation des cellules de garde des stomates enrichis et isoler des protéines. La qualité des protéines et cellules obtenus ici activation physiologique et autres études biologiques.
Introduction
Stomates jouent un rôle important dans la physiologie et la remise en forme de plantes ensemble. Ces structures spécifiques de plantes minuscules sont formés par deux cellules épidermiques spécialisées appelées cellules stomatiques et sont trouvent plus abondamment sur la face abaxiale des feuilles. Stomates sont nécessaires pour l’échange de gaz entre la plante et l’atmosphère, ainsi que le contrôle des pertes d’eau par transpiration. Réglementer les cellules stomatiques ouverture des stomates grâce à l’intégration de différent externe (par exemple, lumière, humidité, contact de l’agent pathogène, des niveaux de dioxyde de carbone) et internes (p. ex.., hormones endogènes) stimuli1,2. Au cours des 20 dernières années, ce type de cellule est devenu un système modèle pour étudier cellule signalisation processus chez les plantes. Ces cellules forment une petite fraction des cellules totales dans une feuille ; ainsi, afin d’étudier leur cellulaire unique, les propriétés biochimiques et moléculaires d’une manière unicellulaires, il faut les isoler des autres types de cellules de feuille. Dans le passé, études des cellules de garde ont souvent impliqué la préparation des cellules de garde des protoplastes (GCP)3,4,5. Typiquement, cela nécessite l’utilisation de grandes quantités d’enzymes dégradant la paroi cellulaire et ou rupture mécanique par mélange et a prouvé d’être coûteux et fastidieux car il faut généralement plusieurs heures pour préparer un échantillon GCP, souvent de fois avec peu de rendement. Plus important encore, parce que les cellules de garde agissent comme des paires complètes pour réguler l’ouverture des stomates, l’utilisation des BPC peut considérer comme un système artificiel à l’étude de la signalisation des cellules de garde.
Ici, nous avons développé une méthode pour préparer des stomates dans lequel les cellules de garde intactes sont enrichis et maintenir les réactions physiologiques aux stimuli. Cette méthode s’inspire d’une méthode qui a permis d’isoler du mésophylle cellule protoplastes6,7. Dans notre méthode, les stomates sont préparés selon claire ruban Scotch pour séparer tout d’abord la majorité des cellules du mésophylle jointe à la couche adaxiale de la feuille de la couche abaxiale contenant les chaussées et les cellules stomatiques. Cela se fait par l’apposition d’un morceau de ruban de chaque côté de la feuille et les peeling appart. Les cellules de la couche abaxiale sont autorisés à récupérer sous la lumière dans un tampon de l’ouverture des stomates. Plus tard, les cellules restantes de la chaussée sont supprimés à l’aide d’une petite quantité d’enzymes, laissant derrière elle des cellules de garde qui s’enrichissent sur la bande de dégradant les parois cellulaires.
Dans cette méthode simple, stomatiques cellules stomatiques qui soient viables et adaptés peuvent rapidement et efficacement être prêt, en moins d’une heure pour obtenir des cellules de garde des stomates enrichis de 50 peelings avec un coût minime. La méthode ici impose moins de dommages aux cellules végétales que les méthodes précédentes où sont préparés les protoplastes. En outre, les matières recueillies de cette méthode rendement protéines souhaitable s’élève. Surtout, parce que la feuille n’est pas soumise à la fusion ou temps de digestion longue et cellules stomatiques sont intacts, les résultats d’études sera plus étroitement des celui de la garde physique biologie d’une cellule. Avec cette méthode, stomatiques mouvements peuvent être reliées en temps réel à des changements au niveau moléculaire. Ainsi, les connaissances acquises grâce à des études à l’aide de cette méthode de préparation serait important pour une compréhension plus complète de la signalisation des cellules de garde.
Nous avons utilisé la plante Arabidopsis thaliana comme modèle ; Toutefois, le présent protocole peut être appliqué à l’enrichissement de stomatiques cellules stomatiques chez d’autres espèces végétales telles que Brassica napus avec de petites modifications dans le temps de digestion. Comme une preuve de concept, nous avons démontré que stomatiques cellules stomatiques, enrichis par l’intermédiaire de cette méthode sont viables et réactif aux stimuli comme indiqué par le dosage de fluorescéine diacétate (FDA) et les études utilisant l’hormone végétale l’acide abscissique (ABA), respectivement. En outre, nous avons démontré que les protéines de haute qualité peuvent être isolés dans ces cellules stomatiques. Nous décrivons ici un protocole détaillé de ce processus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules de garde sont un système modèle pour l’étude des mécanismes de transduction de signal dans les plantes et il est important de veiller à ce que la préparation des échantillons utilisés dans l’étude est la plus appropriée pour répondre à des questions biologiques. Malgré l’intérêt croissant pour les cellules de garde au sein de la communauté de recherche plante, il n’y a aucune méthode universelle sur comment préparer les cellules stomatiques stomatiques qui permettrait à la fois le …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Daniel Chen du numérique vidéo Production équipe de Buchholz High School pour l’assistance au montage de la vidéo. Cette recherche sur les cellules de garde des stomates, protéomique et métabolomique dans le laboratoire de Chen a été soutenue par des subventions de la US National Science Foundation (0818051, 1158000 et 1412547). Wenwen Kong est pris en charge par le China Scholarship Council. M. Qiuying Pang est pris en charge par le China Scholarship Council et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31570396).
Materials
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
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