Muis en mens-afkomstige primaire maag epitheliale enkelgelaagde cultuur voor de studie van regeneratie
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor de vaststelling en het kweken van mens – en muis-afgeleide 3-dimensionale (3D) maag organoids, en de methode voor de overdracht van 3D organoids naar een 2-dimensionale enkelgelaagde. Het gebruik van de maag epitheliale enkelgelaagde als een roman kras-wond assay voor regeneratie studies wordt ook beschreven.
Abstract
In vitro studies van maag wond reparatie betekent meestal dat het gebruik van maagkanker cellijnen in een kras-wond assay van cellulaire proliferatie en migratie. Een belangrijke beperking van deze gehaltebepalingen, is echter hun homogene assortiment cellulaire soorten. Reparatie is een complex proces dat vraagt om de interactie van verschillende celtypes. Daarom, om te bestuderen van een cultuur verstoken van cellulaire subtypes, is een zorg die moet worden overwonnen als we gaan begrijpen van het herstelproces. Het model van de maag organoid kan dit probleem waarbij de heterogene collectie van celtypes aansluit bij die van de maag epitheel of andere inheemse weefsels in vivoverlichten. Aangetoond hier is een roman, in vitro kras-wond assay, afgeleid van de mens of de 3-dimensionale organoids muis, die vervolgens kunnen worden overgedragen aan een maag epitheliale enkelgelaagde als beide intact organoids of als een enkele celsuspensie van losgekoppeld organoids. Het doel van het protocol is om organoid afkomstige maag epitheliale monolayers die kunnen worden gebruikt in een roman kras-wond assay-systeem om te studeren maag regeneratie.
Introduction
Het gebruik van nul-wond tests is een populaire methode voor het bestuderen van de reparatie en regeneratie1,2,3,4,5,6. De voorgestelde methodologie kan worden gebruikt om specifiek bestuderen maag regeneratie en Helicobacter pylori kolonisatie. In het verleden, maagkanker cellijnen zijn gebruikt als een middel om te studeren van Helicobacter pylori (H. pylori) infectie1,2 en tot onlangs maagkanker cellijnen zoals AGS cellen waren favoriet1 ,2,3,4. Een beperking van de celculturen maagkanker is hun falen om te recapituleren de cellulaire diversiteit van de maag epitheel. Als u wilt proberen om deze beperking, aangetoond dat zij dat hier is de oprichting en overdracht van primaire mens – en muis-afgeleide 3-dimensionale fundic maag organoids (FGOs) een maag epitheliale enkelgelaagde voor wond genezing testen op basis van een gewijzigde methode eerst beschreven door Schlaermann et al. 7 we aantonen dat maag epitheliale monolayers afgeleid van 3D maag FGOs geschoren of FGO-afgeleide enkele cellen behouden een gepolariseerde cellulaire samenstelling die nauw die de maag epitheel vertegenwoordigt in vivo. Gezien het feit dat de cellijnen van maagkanker doen niet aantonen dat de samenstelling van de cel die deze techniek wordt weergegeven, heeft het huidige protocol een voordeel ten opzichte van alternatieve kras-wond controlemethodes. Deze methodologie is geoptimaliseerd waarbij monolayers worden kunnen gevestigd uit hele organoids of uit een enkele celsuspensie van gedissocieerde organoids en vergulde met behulp van een kelder membraan matrix of collageen-coating. Het algemene doel van dit protocol is om dat een organoid afgeleid maag epitheliale enkelgelaagde culturen voor een nieuwe wond genezing assay.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol detailleert de oprichting van mens – en muis-afgeleide maag epitheliale monolayers die kunnen worden gebruikt voor kras-wond testen. Het protocol is afhankelijk van het concept van de cel van de stam van de resident los van de primaire mens (of muis) weefsels en is een gewijzigd protocol voor het eerst gepubliceerd door Schlaermann et al.7. Wij hebben met name het protocol hier geoptimaliseerd om een heuvels en gepolariseerde maag epitheliale enkelgelaagde welke spree…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 verlenen (YZ).
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
- Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
- Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
- Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
- Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
- Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
- Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
- Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
- Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
- Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
- Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).
