यहां हम एक widefield उच्च सामग्री विश्लेषण प्रणाली (WHCAS) का उपयोग कर स्लाइड पर फ्लोरोसेंट से लेबल किए गए ऊतकों के स्वचालित विभाजन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल व्यापक है किसी भी क्षेत्र है जो जैव विज्ञान, चिकित्सा अभियांत्रिकी, और स्वास्थ्य विज्ञान सहित जैविक ऊतकों में फ्लोरोसेंट मार्करों के quantitation शामिल में आवेदन पत्र ।
स्वचालित स्लाइड स्कैनिंग और फ्लोरोसेंट-लेबल वाले ऊतकों के विभाजन पूरी स्लाइड या बड़े ऊतक वर्गों का विश्लेषण करने के लिए सबसे कारगर तरीका है । दुर्भाग्य से, कई शोधकर्ताओं समय और संसाधनों की बड़ी मात्रा में खर्च के विकास और कार्यप्रवाह है कि केवल अपने प्रयोगों के लिए प्रासंगिक है अनुकूलन । इस अनुच्छेद में, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक widefield उच्च सामग्री विश्लेषण प्रणाली (WHCAS) के लिए उपयोग के साथ उन द्वारा उपयोग किया जा सकता है किसी भी स्लाइड-घुड़सवार ऊतक छवि, पूर्व में अनुकूलन के लिए विकल्प के साथ, निर्मित मॉड्यूल में पाया संबंधित सॉफ्टवेयर में मिला वर्णन । नहीं मूल रूप से स्लाइड स्कैनिंग के लिए, इस लेख में विस्तृत कदम यह संभव WHCAS जो संबद्ध सॉफ्टवेयर में आयात किया जा सकता है में स्लाइड स्कैनिंग छवियों को प्राप्त करने के लिए करना । इस उदाहरण में, ब्रेन ट्यूमर स्लाइड के स्वचालित विभाजन प्रदर्शन किया है, लेकिन किसी भी फ्लोरोसेंट-लेबल परमाणु या cytoplasmic मार्कर के स्वचालित विभाजन संभव है । इसके अलावा, वहाँ प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए परख सहित अन्य मात्रात्मक सॉफ्टवेयर मॉड्यूल की एक किस्म है/translocation, सेलुलर प्रसार/व्यवहार्यता/apoptosis, और angiogenesis कि चलाया जा सकता है । इस तकनीक के शोधकर्ताओं समय और प्रयास को बचाने और स्लाइड विश्लेषण के लिए एक स्वचालित प्रोटोकॉल बनाने होगा ।
स्लाइडों पर फ्लोरोसेंट-लेबल वाले ऊतकों की सटीक और सटीक quantitation कई वैज्ञानिक क्षेत्रों में एक अत्यधिक मांग के बाद तकनीक है । हालांकि, शोधकर्ताओं अक्सर मैंयुअल रूप से नमूनों की गिनती या समय के काफी मात्रा में खर्च गूढ़ स्वचालित तकनीक विकसित करने के लिए इस लक्ष्य को प्राप्त । इस के साथ साथ, हम स्वचालित स्लाइड स्कैनिंग और एक उदाहरण के रूप में जमे हुए मानव मस्तिष्क ट्यूमर वर्गों में सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ एक WHCAS और उसके संबद्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कोशिकाओं के quantitation के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । संबद्ध सॉफ्टवेयर की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदान करता है निर्मित neurite से अनुकूलन मॉड्यूल में सेल प्रकार के भेदभाव के लिए गिनती1,2,3,4,5, 6. इस विधि का लक्ष्य एक शुरू करने के लिए खत्म, आसानी से reproducible प्रोटोकॉल की छवियों को प्राप्त करने के लिए और किसी भी स्लाइड-माउंटेड ऊतकों में quantitate फ्लोरोसेंट-लेबल संस्थाओं के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करने के लिए है ।
इस प्रोटोकॉल में, WHCAS मुख्य रूप से संबंधित सॉफ़्टवेयर पर क्रमिक विश्लेषण के लिए इमेजिंग प्लेट्स के लिए उपयोग किया जाता है भले ही कोई स्लाइड एडेप्टर और7 स्कैन करने के लिए मूल बातें उपलब्ध थीं । यह छवि स्लाइड के लिए निषिद्ध था क्योंकि अधिग्रहण क्षेत्र के सावधान स्थानिक अंशांकन, उपयुक्त पत्रिकाओं के चयन, सिलवाया loadouts के निर्माण, और उत्पाद के प्रतिनिधियों के साथ एक संपर्क की आवश्यकता थी । साहित्य के व्यापक शरीर में, एक समर्पित स्लाइड-इमेजिंग और विश्लेषण उपकरण8खरीद के एवज में, इस सॉफ्टवेयर के उपयोग के साथ एक पिछले तकनीकी रिपोर्ट WHCAS पर स्लाइड की छवि अधिग्रहण दरकिनार9। विभिंन प्लेटफार्मों पर छवि अधिग्रहण या छवि विश्लेषण प्रदर्शन आवश्यक अतिरिक्त काम करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक दूसरे के साथ संगत है ।
WHCAS और छवि पर कब्जा करने के लिए अपने सॉफ्टवेयर का उपयोग करने की क्षमता के लिए खोज या एक कार्यप्रवाह इन उपकरणों के लिए विदेशी विकासशील की अनावश्यक जटिलताओं से बचना होगा । इस अनुच्छेद में, एक थाली के रूप में स्लाइड के इलाज के द्वारा एक कम आवर्धन अवलोकन स्कैन और इसी उच्च आवर्धन छवियों बनाने के लिए आवश्यक कदम, और बाद के विश्लेषण बहु तरंग दैर्ध्य सेल स्कोरिंग विभाजन मॉड्यूल का उपयोग कर के लिए अनुमति repurposing का WHCAS । यह आसानी से प्रयोग करने योग्य प्रोटोकॉल वैकल्पिक तकनीक पर एक लाभ प्रदान करता है क्योंकि वहां कोई एल्गोरिदम या बहु कदम गिनती प्रोटोकॉल10,11 एक बार छवियों WHCAS पर अधिग्रहीत कर रहे है विकसित करने की जरूरत है । इस प्रोटोकॉल को एक quantitation तकनीक का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक समय कम है, और अधिक सटीक है12 और मैनुअल गिनती से कुशल और WHCAS के उपयोग को अधिकतम । इस प्रोटोकॉल व्यापक रूप से किया जा सकता है और आसानी से इस्तेमाल के बाद से यह इमेजिंग और स्लाइड पर किसी भी फ्लोरोसेंट-लेबल ऊतकों का विश्लेषण सक्षम बनाता है ।
एक आम समस्या अभी भी जैविक विज्ञान अनुसंधान की दक्षता में बाधा, के लिए प्रोटोकॉल का विकास है निष्पक्ष, सटीक, और सटीक ठहराव की फ्लोरोसेंट-लेबल के ऊतकों और उनके संरचनाओं के भीतर । समय और प्रयास की महत्वपूर्ण मात्रा में ऊतक स्लाइड का विश्लेषण करने के तरीके एक बार वे imaged गया है खोजने की दिशा में निर्देशित कर रहे हैं । कई मौजूदा विधियां उपयोगकर्ताओं को प्रोग्राम के भीतर12,13,14फिर से बनाने के लिए एल्गोरिदम प्रदान करते हैं । इन पद्धतियों स्वीकार्य हैं, लेकिन इस रिपोर्ट का महत्व है कि यह उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है आसानी से और जल्दी से एक समग्र छवि अधिग्रहण और विश्लेषण प्रोटोकॉल स्थापित यदि उपयोगकर्ता एक WHCAS के लिए उपयोग किया है । परख है कि कोशिका प्रकार अंतर और एकाधिक संरचनाओं और प्रक्रियाओं, कोशिका चक्र विश्लेषण, और परमाणु translocation, उदाहरण के लिए, पहले से ही संबद्ध सॉफ्टवेयर में उपलब्ध है यों तो ।
सेटअप में कुछ महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं । सबसे पहले, स्लाइड के स्थानिक मापदंडों के रूप में परिभाषित कर रहे है अगर यह एक थाली थे । दूसरे, एक कम आवर्धन अवलोकन स्कैन बनाया गया है जिसमें से ब्याज के क्षेत्रों उच्च आवर्धन इमेजिंग के लिए चुना जाता है । अंत में, सटीकता और बाद में विश्लेषण की परिशुद्धता को प्रभावित साइटों को बाहर रखा गया है । इस तकनीक की सबसे बड़ी सीमा है कि इसकी प्रयोज्यता पर निर्भर करता है अगर उपयोगकर्ता एक WHCAS के लिए उपयोग किया है । हालांकि, उच्च सामग्री विश्लेषण प्रणालियों के लिए बढ़ती जरूरत के साथ, कई संस्थाओं को अपने शोधकर्ताओं को इन प्रदान कर रहे है प्रतिस्पर्धी रहने के लिए15। समस्या निवारण सबसे अधिक आवश्यक है जब ऊतक वर्गों एक ही मोटाई नहीं है । यदि ब्याज के कई क्षेत्रों का चयन किया जाता है, कुछ ध्यान में होगा, जबकि दूसरों को नहीं होगा । आदर्श रूप में, अनुभाग के दौरान, उपयोगकर्ता के लिए सजातीय नमूने बनाने के ख्याल रखना होगा । हालांकि, अगर नमूने असंगत हैं, परमाणु दाग तरंग दैर्ध्य पर ध्यान केंद्रित (या उपयोगकर्ता के प्रतिभाशाली fluorophore), जो ध्यान केंद्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, प्रत्येक के बाहर-फोकस क्षेत्र के लिए पुनः समायोजन किया जा सकता है ब्याज की और यहां तक कि देखने के प्रत्येक क्षेत्र के लिए । के रूप में अंय तरंग दैर्ध्य बस परमाणु दाग तरंग दैर्ध्य से भरपाई कर रहे हैं, केवल इस तरंग दैर्ध्य पुनर्समायोजन की जरूरत है ।
इस रिपोर्ट में, हम विस्तार से एक WHCAS और संबद्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके स्लाइड को स्कैन और विश्लेषित कैसे करें । बहु-तरंग दैर्ध्य कोशिका स्कोरिंग मॉड्यूल उपयोगकर्ता स्वचालित रूप से किसी भी परमाणु या cytoplasmic मार्करों कि फ्लोरोसेंट लेबल कर रहे हैं गिनती करने के लिए अनुमति देता है. फोकस सेटिंग्स को समायोजित करने और चौड़ाई और क्षेत्र के रूप में सेलुलर विशेषताओं को परिभाषित करने के लिए छवि के लिए मॉड्यूल अनुकूलित करने के बाद, वहां छवि स्लाइड और मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के लिए कोई आगे की जरूरत है । अप करने के लिए तीन स्लाइड एक समय में imaged किया जा सकता है और ब्याज के कई क्षेत्रों परिभाषित किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल WHCAS उपयोगकर्ताओं को स्लाइडों का विश्लेषण करने की आवश्यकता है जो अनुकूलन, बहुउद्देशीय, स्वचालित कार्यप्रवाह है कि कोई अनुकूलन के लिए कम की आवश्यकता का लाभ ले और भविष्य में किसी भी परियोजनाओं में लागू किया जा सकता है कि ऊतक के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण शामिल ।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना के स्वास्थ्य अनुसंधान और अलबर्टा के कनाडाई संस्थानों से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया-स्वास्थ्य समाधान/ लेखक अपने उपकरणों के उपयोग के लिए तंत्रिका जीव विज्ञान कोर सुविधा में पुनर्जनन इकाई को स्वीकार करना चाहते हैं, जो नींव पर WHCAS पर स्कैनिंग स्लाइड संभव बनाया गया था, और उत्पादों के निर्माता के निर्माण में पाउला Gedraitis का काम इस अनुच्छेद में उल्लेख किया है, आणविक उपकरणों ।
ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL | Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |