Her beskriver vi en protokol til den automatiserede segmentering af fluorescently mærket væv på dias ved hjælp af en widefield høj-indhold analysesystem (WHCAS). Denne protokol har omfattende programmer på ethvert område, der involverer kvantitering af fluorescerende markører i biologisk væv, herunder biologiske videnskaber, medicinsk teknik og Sundhedsvidenskab.
Automatiseret diasscanning og segmentering af fluorescently mærket væv er den mest effektive måde at analysere hele dias eller store væv sektioner. Desværre, mange forskere bruger store mængder af tid og ressourcer at udvikle og optimere arbejdsgange, der er kun relevante for deres egne eksperimenter. I denne artikel vil beskrive vi en protokol, der kan bruges af personer med adgang til en widefield høj-indhold analysesystem (WHCAS) til billede slide-monteret væv, med muligheder for tilpasning inden for præfabrikerede moduler findes i den tilhørende software. Ikke oprindeligt beregnet til dias scanning, gør trinene i denne artikel i det muligt at erhverve diasscanning billeder i den WHCAS, som kan importeres til det tilknyttede programmel. Automatiseret segmenteringen af hjernen tumor dias er vist i dette eksempel, men den automatiserede segmentering af enhver fluorescently mærket nukleare eller cytoplasmatisk markør er muligt. Derudover er der en række andre kvantitative softwaremoduler herunder assays til protein lokalisering/translokation, cellulære spredning/levedygtighed/apoptose og angiogenese, der kan køres. Denne teknik vil spare forskere tid og kræfter og skabe en automatiseret protokol for dias analyse.
Den nøjagtige og præcise kvantitering af fluorescently mærket væv på dias er et yderst eftertragtede teknik inden for mange forskningsområder. Men forskere ofte manuelt tælle prøver eller bruge betydelige mængder af tid på at udvikle esoteriske automatiseret teknikker for at opnå dette. Heri, giver vi en protokol for automatiseret diasscanning og kvantitering af celler ved hjælp af en WHCAS og dens tilhørende software, med medfødte immun celler i frosne menneskelige hjerne tumor sektioner som eksempel. Den tilhørende software tilbyder en bred vifte af indbyggede tilpasselig moduler fra neurite udvækst tælle til differentiering af celle typer1,2,3,4,5, 6. Målet med denne metode er at give forskere med en start-til-finish, let at reproducere protokol at erhverve billeder af og kvantificere fluorescently mærket enheder i enhver slide-monteret væv.
I denne protokol bruges WHCAS primært til imaging plader til efterfølgende analyse på det tilknyttede programmel, selvom et dias adapter og grundlæggende til dias scanning7 var til rådighed. Det var uoverkommelige til billede dias fordi forsigtig rumlige kalibrering af området erhvervelse, udvælgelse af relevante kladder, oprettelse af skræddersyede loadouts og en forbindelsesofficer med produkt repræsentanter var påkrævet. I den bredere krop af litteratur, i stedet for at købe en dedikeret slide-billedbehandling og analyse apparater8, omgås en teknologisk betænkning med adgang til denne software image erhvervelse af dias på WHCAS helt9. Udføre image erhvervelse eller billede analyse på forskellige platforme kræver ekstra arbejde for at sikre hver er kompatibel med den anden.
Evnen til at bruge WHCAS og dets software til billedoptagelse ville undgå de unødvendige komplikationer af søger eller udvikle en arbejdsproces fremmede til disse værktøjer. I denne artikel, foranstaltninger krævede hen til oprette en lav forstørrelse oversigt scanning og de tilsvarende høj forstørrelse billeder ved at behandle diasset som en plade og de efterfølgende analyser ved hjælp af modulet multi bølgelængde celle Scoring segmentering giver mulighed for at nyorientering af WHCAS. Denne let anvendelige protokol giver en fordel frem for alternative teknikker, fordi der er ingen grund til at udvikle algoritmer eller Multi-trins tælle protokoller10,11 , når billederne er erhvervet på WHCAS. Denne protokol afbøder tidsforbruget til at optimere en kvantitering teknik, er mere præcis12 og effektiv end manuel optælling og maksimerer anvendelsen af WHCAS. Denne protokol kan anvendes bredt og nemt da det muliggør billedbehandling og analyse af enhver fluorescently mærket væv på dias.
En fælles problem stadig hæmme effektiviteten af biologisk videnskabsforskning er udviklingen af protokoller for saglig, nøjagtig og præcis kvantificering af fluorescently mærket væv og deres strukturer inden for. Betydelige mængder af tid og indsats er rettet mod at finde måder at analysere væv dias, når de har blevet afbildet. Mange eksisterende metoder giver algoritmer nemlig brugernes hen til genskabe inden for programmer12,13,14. Disse metoder er acceptabel, men betydningen af denne betænkning er, at det gør det muligt for brugeren at hurtigt og nemt oprette et holistisk billede erhvervelse og analyse protokol hvis brugeren har adgang til en WHCAS. Assays, at differentiere celletyper og kvantificering flere strukturer og processer, celle cyklus analyse og nukleare translokation, for eksempel, er allerede til rådighed i det tilknyttede programmel.
Opsætningen omfatter et par kritiske trin. For det første, de rumlige parametre af diaset er defineret som om det var en plade. For det andet oprettes en lav forstørrelse oversigt scanning, hvorfra regioner af interesse er valgt for høj forstørrelse billeddannelse. Endelig, websteder, der påvirker nøjagtighed og præcision af efterfølgende analyser er udelukket. Den største begrænsning af denne teknik er, at dens anvendelighed afhænger af hvis brugeren har adgang til en WHCAS. Dog med det stigende behov for høj-indholdsanalyse systemer, der mange institutioner leverer disse til deres forskere at forblive konkurrencedygtige15. Fejlfinding er nødvendig oftest når væv sektioner ikke har samme tykkelse. Hvis flere regioner af interesse er markeret, vil nogle være i fokus, mens andre ikke vil. Ideelt set ved skæring, ville brugeren tage sig for at skabe homogene prøver. Men hvis prøverne er inkonsekvent, fokus på den nukleare pletten bølgelængde (eller brugerens lyseste fluorophore), som bruges til at fokusere, kan justeres for hver out-of-fokus område af interesse og selv for hver synsfelt. Som de andre bølgelængder er simpelthen forskudt fra den nukleare pletten bølgelængde, brug kun denne bølgelængde omstilling.
I denne betænkning detaljer vi hvordan man kan scanne og analysere dias ved hjælp af en WHCAS og tilhørende software. Modulet flere bølgelængde celle Scoring tillader bruger hen til automatisk tælle alle nukleare eller cytoplasmatisk markører, der betegnes fluorescently. Efter justering af fokus indstillingerne og cellulære kendetegn, såsom bredde og område til at tilpasse modulet til væv afbildet, er der ikke længere behov for indgriben fra brugeren at skaffe de afbildede dias og kvantitative data. Op til tre dias kan være afbildet på et tidspunkt og flere regioner af interesse kan defineres. Denne protokol giver mulighed for WHCAS brugere, som skal analysere dias drage fordel af tilpasselig, MP, automatiserede arbejdsprocesser, der kræver lidt eller ingen optimering og kan anvendes i alle projekter i fremtiden, der involverer den histologiske analyse af væv.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev finansieret af et tilskud fra den canadiske institutter for sundhedsforskning og Alberta innoverer – sundhed løsninger/Alberta Cancer Foundation. Forfatterne vil gerne anerkende regenerering enhed i neurobiologi core facilitet for brugen af deres udstyr, Paula Gedraitis arbejde i bygge fundamentet, hvorpå diasscanning på WHCAS blev muliggjort, og skaberen af produkterne nævnt i denne artikel, molekylære enheder.
ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL | Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |