Her beskriver vi en protokoll for automatisk segmentering av fluorescently merket vev på lysbilder ved hjelp av en widefield høyt innhold analysesystem (WHCAS). Denne protokollen har omfattende programmer i alle felt som innebærer kvantifisering av fluorescerende markører i biologisk vev inkludert biologi, medisinsk engineering og helsefag.
Automatisert lysbildet skanning og segmentering av fluorescently-merket vev er den mest effektive måten å analysere hele lysbilder eller store vev deler. Dessverre, mange forskere tilbringe store mengder tid og ressurser utvikle og optimalisere arbeidsflyter som er bare relevant for egne eksperimenter. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll som kan brukes av dem med adgang å en widefield høyt innhold analysesystem (WHCAS) til bilde noen lysbilde montert vev, med alternativer for tilpasning i pre-bygget moduler finnes i den tilknyttede programvaren. Ikke opprinnelig ment for lysbildet skanning, gjør trinnene i denne artikkelen det mulig å kjøpe lysbildet skanne bilder i WHCAS som kan importeres til den tilknyttede programvaren. Automatisert oppdeling av hjerne svulst lysbilder er demonstrert i dette eksemplet, men automatisert oppdeling av noen fluorescently-merket kjernefysiske eller cytoplasmatiske markør er mulig. Videre finnes det en rekke andre kvantitative programvaremoduler inkludert analyser for protein lokalisering/translokasjon og mobilnettet spredning/levedyktighet/apoptose angiogenese som kan kjøres. Denne teknikken vil spare forskere tid og opprette en automatisert protokoll for lysbildet analyse.
Nøyaktig og presis kvantifisering av fluorescently-merket vev på lysbilder er en svært ettertraktet teknikk i mange vitenskapelige felt. Men forskere ofte manuelt teller prøver eller tilbringe store mengder tid utvikle esoteriske automatisert teknikker for å oppnå dette. Her gir vi en protokoll for automatisert lysbildet skanning og kvantifisering av celler ved hjelp av en WHCAS og tilhørende programvaren, med medfødte immunceller i frosne menneskelige hjerne svulst delene som et eksempel. Den tilknyttede programvaren tilbyr en rekke innebygde passelig moduler fra neurite utvekst opptellingen å differensiering av cellen typer1,2,3,4,5, 6. målet med denne metoden er å gi forskerne en start-til-avslutning, å reprodusere protokollen hente bilder av og quantitate fluorescently-merket enheter i noen lysbilde montert vev.
I denne protokollen brukes hovedsakelig til WHCAS for imaging plater for senere analyse på den tilknyttede programvaren selv om et lysbilde-kort og grunnleggende for å skyve skanning7 var tilgjengelig. Det var uoverkommelige bilde lysbildene fordi forsiktig romlige kalibrering av oppkjøpet området, valg av riktige journalene, etableringen av skreddersydd loadouts og et samarbeid med produktet representanter var nødvendig. I selve bredere litteratur, i stedet for kjøpe en dedikert lysbilde-imaging og analyse apparat8, omgås en tidligere teknologiske rapport med tilgang til denne programvaren bilde oppkjøpet av lysbildene i WHCAS helt9. Utføre bildeanalyser anskaffelse eller bildet på forskjellige plattformer nødvendiggjør ekstra arbeid for å sikre hver er kompatibel med den andre.
Muligheten til å bruke WHCAS og programvaren for bildebehandling ville unngå unødvendige komplikasjoner av søker eller utvikle en arbeidsflyt fremmed for disse verktøyene. I denne artikkelen trinnene nødvendig for å opprette en lav forstørrelse oversikt skanning og tilsvarende høy forstørrelse bilder ved å behandle lysbildet som en plate og påfølgende analysene bruker flere bølgelengde celle Scoring segmentering modulen tillater det gjenbruk av WHCAS. Denne lett brukbare protokollen gir en fordel over alternative teknikker fordi det er ikke nødvendig å utvikle algoritmer eller flere trinn telling protokoller10,11 når bildene er ervervet på WHCAS. Denne protokollen reduserer tiden det tar å optimalisere en kvantifisering teknikk, er mer presis12 og effektiv enn manuelt teller og maksimerer bruk av WHCAS. Denne protokollen kan mye og enkelt brukes siden det gjør den bildebehandling og analyse av alle fluorescently-merket vev på lysbilder.
Et vanlig problem fremdeles hindrer effektiviteten av biologisk forskning er utviklingen av protokoller for objektiv, nøyaktig og presis kvantifiseringen fluorescently-merket vev og deres strukturer i. Betydelige mengder tid og krefter er rettet mot å finne måter å analysere vev lysbilder når de har blitt avbildet. Mange eksisterende metoder gir algoritmer for brukernes å gjenskape i programmer12,13,14. Disse metodene er akseptable, men betydningen av denne rapporten er at den lar brukeren raskt og enkelt opprette en helhetlig bildeopptak og analyse protokollen hvis brukeren har tilgang til en WHCAS. Analyser som skille celletyper og kvantifisere flere strukturer og prosesser, celle syklus analyse og kjernefysiske translokasjon, for eksempel, er allerede tilgjengelig i den tilknyttede programvaren.
Oppsettet innebærer noen viktige skritt. Spatial parametere av lysbildet defineres først som om det var en plate. Dernest opprettes en lav forstørrelse oversikt skanning som regioner av interesse er valgt for forstørring bildebehandling. Til slutt, nettsteder som påvirker nøyaktighet og presisjon av påfølgende analyser er utelukket. Den største begrensningen for denne teknikken er at brukbarheten avhenger av om brukeren har tilgang til en WHCAS. Men med det økende behovet for høyt innhold analyse systemer gir mange institusjoner disse forskere å være konkurransedyktig15. Feilsøking er nødvendig oftest når vev deler ikke har samme tykkelse. Hvis flere områder av interesse er valgt, vil noen være i fokus mens andre ikke vil. Ideelt sett under snitting, ville brukeren ta seg for å opprette homogene prøver. Men hvis prøvene er inkonsekvent, kan fokus på kjernefysiske flekken bølgelengde (eller brukerens smarteste fluorophore), som brukes til å fokusere, justeres for ute av fokus områder av interesse og selv for hver synsfelt. Som andre bølgelengdene er bare forskjøvet fra kjernefysiske flekken bølgelengde, trenger bare denne bølgelengde omstilling.
I denne rapporten detalj vi skanne og analysere lysbilder ved hjelp av en WHCAS og tilhørende programvare. Flere bølgelengde celle Scoring modulen lar brukeren automatisk telle alle kjernefysiske eller cytoplasmatiske markører fluorescently merket. Etter innstillingene i fokus og definere mobilnettet egenskapene for eksempel bredde og området tilpasse modulen til vev fotografert, er det ikke lenger behov for brukertilsyn fotografert lysbilder og kvantitative data. Opptil tre lysbilder kan avbildes samtidig, og flere områder av interesse kan defineres. Denne protokollen kan WHCAS brukere som trenger å analysere lysbilder dra nytte av passelig, multifunksjonelle, automatiserte arbeidsflyter som krever lite eller ingen optimalisering og kan brukes i alle prosjekter i fremtiden som involverer histologiske analyse av vev.
The authors have nothing to disclose.
Prosjektet ble finansiert av en bevilgning fra kanadiske institutter for helseforskning og Alberta fornyer – helse løsninger/Alberta Cancer Foundation. Forfatterne ønsker å erkjenne gjenfødelse enheten i nevrobiologi kjernen anlegg for bruk av utstyret sitt, et verk av Paula Gedraitis bygge grunnlaget som lysbildet skanning av WHCAS ble gjort mulig og skaperen av produkter nevnt i denne artikkelen, molekylær enheter.
ImageXpress MicroXLS | Molecular Devices | NA | Apparatus for image acquisition |
MetaXpress 5.1 | Molecular Devices | NA | Associated software for ImageXpress MicroXL (runs on a PC with the Windows operating system). |
Slide adapter | Molecular Devices | NA | Metal slide holder that fits into ImageXpress MicroXL |
Slide_Region_Acquisition_revA.jzp | Molecular Devices | NA | The journal can be obtained from metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide or from contacting a Molecular Devices representative |
Slide_Region_Acquisition_Setup.JNL | Molecular Devices | NA | Select this journal in Step 6.6. |