Isolement de cellules primaires de Decidual humaines des Membranes fœtales des placentas à terme
Summary
Ce protocole présente une méthode pour l’isolement de cellules primaires de decidual humains prélevés dans les membranes foetales du placenta à terme qui peut être utilisé pour une variété d’applications (c’est-à-dire l’immunocytochimie, cytométrie en flux, etc.) visant pour étudier le rôle des différentes populations cellulaires dans les complications de la grossesse.
Abstract
La caduque, également connu sous le nom de l’endomètre enceinte, est un tissu reproducteur extrêmement important. Des cellules déciduale, composés principalement de cellules stromales decidualized et des cellules immunitaires, sont responsables de la sécrétion de facteurs hormonaux et inflammatoires qui sont essentiels pour l’implantation réussie de blastocyste, développement placentaire et jouent un rôle dans la déclenchement du travail à terme et prématurés. Plusieurs complications de la grossesse peuvent en découler des perturbations d’un équilibre subtil des différentes populations cellulaires comprenant caduque. Altérations de la proportion des types spécifiques de cellules déciduale peuvent perturber ces processus cruciales et augmenter le risque de développer de graves complications de la grossesse, tels que l’échec de l’implantation embryonnaire, retard de croissance intra-utérin, prééclampsie et travail prématuré. Le protocole décrit ici montre un coût et le temps, une méthode efficace pour l’isolement de cellules primaires de decidual humaines prélevée dans les membranes foetales du placenta à terme. En combinant la digestion enzymatique et douce rupture mécanique du tissu déciduale, un rendement élevé de cellules déciduale a été obtenu avec pratiquement aucune contamination du chorion. Ce qui est important, les cellules isolées de decidual ont été caractérisés (cellules stromales (55-60 %), de leucocytes (35 %), épithélial (1 %) ou cellules trophoblastiques (0,01 %)) et maintenu la viabilité élevée (80 %) qui a été confirmée par multicolore imagerie dosage cytométrie de flux. Ce protocole est spécifique à la parietalis caduque et peut être adapté aux placentas de premier et deuxième trimestres. Une fois isolés, cellules déciduale peuvent être utilisés pour une multitude d’applications expérimentales visant à comprendre le rôle des sous-populations cellulaires déciduale dans les complications de la grossesse.
Introduction
L’endomètre, un des plus actifs tissus femelles adultes, subit une dramatique transformant chaque cycle menstruel en réponse à une stimulation par les hormones ovariennes, le œstrogène (E2) et la progestérone (P4). La caduque, également connu sous le nom de l’endomètre enceinte, est un tissu reproducteur extrêmement important qui est formé à la fin de la phase post-ovulatoire, à la suite de différentiation axée sur les P4 suit la phase proliférative E2-dominante. Déciduale cellules sont responsables de la sécrétion de facteurs hormonaux pour l’implantation du blastocyste réussie et pour le développement de l’interface utéro-placentaire pour maintenir la tolérance maternelle à l’allogreffe foetale.
Décidualisation est nécessaire pour l’implantation et le remodelage subséquente des artères déciduale spirale. Les cellules du stroma endométriales subissent une décidualisation, sous le contrôle du cAMP et P4 pendant la phase lutéale du cycle menstruel1. Ce processus est engagé autour des vaisseaux sanguins et se propage partout dans le stroma, suggérant son rôle dans le remodelage de la vascularisation et de leucocytes traite de règlement. Cette transformation cellulaire se caractérise par une morphologie circulaire, accru la taille du noyau et l’expansion du réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi2. Cellules stromales decidualized sont capables de produire des facteurs paracrines soutenir l’implantation du blastocyste et caractérisent par la sécrétion de nombreuses hormones (prolactine,c’est-à-dire ), facteurs de croissance angiogéniques, facteur de croissance insuline binding protein-1 (IGFBP-1), prostaglandines (PG) E (stimulateur de l’AMPc intracellulaire), les cytokines, les constituants de la matrice extracellulaire et les éléments nutritifs essentiels pour placentaire l’implantation et le développement de3,4,5,6 .
La population cellulaire déciduale n’est pas uniquement composée de cellules stromales decidualized mais contient également des populations de leucocytes déciduale grand, spécifiques à la grossesse. Décidualisation implique un œdème localisé transitoire et afflux de cellules tueuses naturelles de (NK), lymphocytes T, cellules dendritiques et macrophages. La plus grande population de leucocytes est les cellules NK utérines, comprenant environ 50-70 % de tous les leucocytes maternelles s’infiltrer dans la caduque qui sont une source de cytokines et facteurs angiogéniques qui peuvent faciliter le processus de décidualisation et augmenter en nombre tout au long de la grossesse,7. Étant la deuxième plus grande population de cellules immunitaires, les macrophages, sont trouvent autour du site d’implantation et augmentent au cours de la grossesse8. Ils sont une source de cytokines et facteurs de croissance comme colonie stimulant facteur (CSF-1)9, le facteur de nécrose tumorale α (TNFα)10 et prostaglandine (PG) E11.
Tout au long de la grossesse et avant le travail à terme, la caduque est une source majeure de cytokines et de chimiokines, responsable de l’activation des leucocytes périphériques maternelle et migrations subséquentes dans les tissus utérins d’ouvrir la main de œuvre. Les études animales ont montré que nombreuses cytokines pro-inflammatoires sont régulée dans la caduque de souris pendant le travail, telles que TNF-a, IL-6, IL-12 et IL-1 b12. Dans l’humaine caduque, des cytokines pro-inflammatoires IL-1 b, IL-6 et IL-8 (grand chemoattractant neutrophil) pièce expression plus élevée pendant le travail ne contre pas en main de œuvre13. Ces sécrété cytokines entraînent une activation et l’afflux de leucocytes dans les tissus déciduale14; est constaté une augmentation déciduale macrophage et infiltration des neutrophiles dans les deux l’homme et le rat pendant l’accouchement à terme, avec une infiltration déciduale précédant myométriales 4 fois plus grande, ce qui indique une cascade d’activation entre ce deux adjacentes tissus utérins 15. celles-ci s’infiltrer dans les leucocytes produisent PGs capables d’activer les contractions du myomètre16synchrones, métalloprotéinases matricielles (MMP) d’ouvrir la membrane rompent17,18, ainsi que cytokines pro-inflammatoires afin d’amplifier le processus d’activation utérine (« tempête de cytokines »).
En raison de nombreuses fonctions importantes de cellules déciduale, comme jouant un rôle essentiel dans le processus d’implantation, entretien de tolérance materno-foetale en début de gestation et de participer à l’activation du travail à terme, les différentes pathologies peuvent survenir pendant grossesse. Par exemple, (1) infertilité due à l’échec de l’implantation récurrente et perte récurrente de grossesse peut résulter d’une omission de decidual maturation ; (2) restriction de la croissance intra-utérine (RCIU) et pré-éclampsie dues à une mauvaise évolution et dysfonction de la caduque/placenta ou compromise transformation vasculaire à la jonction de decidual-myométriales ; ainsi que de la prématurité (3), qui peut résulter d’activation déciduale prématurée.
À la lumière de ces troubles majeurs, couplés avec des limites éthiques et pratiques humaines in vivo études, établir des lignées humaines déciduale primaire est essentielle pour in vitro d’analyse dans le but de mieux comprendre et améliorer la prise en charge clinique des complications de la grossesse. Par conséquent, l’objectif de notre recherche était d’élaborer un protocole qui permet d’isoler des cellules humaines de decidual primaires avec un rendement cellulaire élevée et viabilité prélevés dans les membranes foetales du placenta à terme. Ce protocole actuel a clairement décrit une méthode de temps – et rapport coût – entrée pour isoler des sous-types spécifiques de decidual cellules qui être utilisé pour une variété d’analyses de in vitro . Caractérisation de l’abondance et le phénotype des sous-populations déciduale à terme et comparaison au premier ou deuxième trimestre sont cruciales de définir leurs rôles tout au long de la gestation humaine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici montre un coût et le temps, une méthode efficace pour isoler des cellules primaires de decidual prélevée dans les membranes foetales de placenta humain à terme très accessible et simple. Le succès de ce protocole dépend de deux facteurs essentiels, (1) efficacité de decidual grattage de la couche de chorion des membranes foetales et (2) le soin avec lequel les cellules déciduale sont traités tout au long du protocole. Il est important que la contamination des tissus chorion est contrô…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimeraient remercier les donateurs, la biobanque de RCWIH et le département d’obstétrique de l’hôpital Mount Sinai/UHN et obstétrique pour les spécimens humains utilisés dans cette étude. Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Lye, particulièrement le Dr Caroline Dunk pour son aide à l’élaboration de la méthode. Ce travail est soutenu par le Fonds de bienvenue de Burroughs (subvention #1013759).
Materials
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope – Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer – Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
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