Isolering av primära mänskliga Decidual celler från foster hinnor av termen efterbörd
Summary
Detta protokoll visar en metod för isolering av primära mänskliga decidual celler som samlats in från fostrets hinnor av termen efterbörd som kan användas för en mängd applikationer (dvs immuncytokemi, flödescytometri, etc.) som syftar att studera olika cellpopulationer i graviditetskomplikationer roll.
Abstract
Decidua, även känd som gravid endometriet, är ett kritiskt viktiga reproduktiva vävnad. Decidual celler, består huvudsakligen av decidualized stromaceller och immunceller, är ansvariga för utsöndringen av hormonella och inflammatoriska faktorer som är avgörande för framgångsrik blastocysten implantation, placenta utveckling och spela en roll i den initiering av arbete på sikt och prematura. Många komplikationer kan uppstå störningar i en fin balans av olika cellpopulationer bestående av decidua. Förändringar i andelen särskilda decidual celltyper kan störa dessa avgörande processer och öka risken för att utveckla allvarliga komplikationer av graviditet, embryo implantation misslyckande, intrauterin tillväxt begränsning, preeklampsi och prematura labor. Protokollet beskrivs här visar en kostnad och tid effektiv metod för isolering av primära mänskliga decidual celler som samlats in från fostrets hinnor av termen efterbörd. Genom att kombinera enzymatisk nedbrytning och skonsam mekaniska störningar av decidual vävnad, erhölls en hög avkastning av decidual celler med praktiskt taget ingen chorion förorening. Ännu viktigare, isolerade decidual celler präglades (stromaceller (55-60%), leukocyter (35%), epitelial (1%) eller trofoblaster (0,01%) celler) och underhålls hög lönsamhet (80%) vilket bekräftades av multicolor imaging flöde flödescytometri assay. Detta protokoll är specifik för den decidua parietalis och kan anpassas till första och andra trimestern efterbörd. När isolerade, kan decidual celler användas för en mängd experimentella program som syftar till att förstå rollen som olika decidual cell subpopulationer i graviditetskomplikationer.
Introduction
Endometriet, en av de mest aktiva vuxna kvinnliga vävnaderna, genomgår dramatiska remodeling varje menstruationscykel som svar på stimulering av äggstockshormoner, östrogen (E2) och progesteron (P4). Decidua, även känd som gravid endometriet, är ett kritiskt viktiga reproduktiva vävnad som bildas i slutet av fasen postovulatory till följd av P4-driven differentiering efter E2-dominerande proliferativa fas. Decidual celler är ansvariga för utsöndringen av hormonella faktorer för framgångsrik blastocysten implantation och för utveckling av utero-placenta-gränssnittet för att upprätthålla maternell tolerans mot den fetala transplantatavstötning.
Decidualization krävs för implantation och efterföljande omdaning av decidual spiral artärerna. Livmodercancer stromaceller genomgå decidualization, under kontroll av P4 och läger, under sena lutealfas av menstruationscykeln1. Denna process initieras runt blodkärl och sprider sig i hela stroma, föreslår dess roll i kärlsystemet remodeling och leukocyt människohandel förordning. Denna cellulära omvandling kännetecknas av en cirkulär morfologi, ökad kärnkraft storlek och utbyggnad av grov endoplasmatiska retiklet och Golgi apparaturen2. Decidualized stromaceller kan producera parakrin faktorer som stöder blastocysten implantation och kännetecknas av utsöndringen av ett flertal hormoner (dvs prolaktin), tillväxt angiogena, insulin tillväxtfaktor bindande protein-1 (IGFBP-1), prostaglandin (PG) E (stimulator av intracellulära cAMP), cytokiner, extracellulär matrix komponenter och näringsämnen som är väsentliga för placenta implantation och utveckling3,4,5,6 .
Decidual cell befolkningen består inte enbart av decidualized stromaceller men innehåller också stora, graviditet-specifika decidual leukocyt populationer. Decidualization innebär övergående lokaliserade ödem och tillströmningen av Natural killer (NK) celler, T-celler, dendritiska celler och makrofager. Den största leukocyt subpopulationen är livmoderns NK-celler, som omfattar cirka 50-70% av alla mödrars leukocyter infiltrera de decidua som är en källa av cytokiner och angiogena faktorer som får stöd i processen decidualization och öka i antal under hela graviditeten7. Makrofager, är den näst största subpopulationen av immunceller, finns runt implanteringsstället och öka under graviditeten8. De är en källa av cytokiner och tillväxt faktorer såsom kolonistimulerande faktor (CSF-1)9, tumörnekrosfaktor α (TNFα)10 och prostaglandin (PG) E11.
Under hela graviditeten, och innan termen förlossningen är decidua en stor källa av cytokiner och chemokiner ansvarar för maternell perifera leukocyter aktivering och efterföljande migration in i livmoderns vävnaderna att inleda arbete. Djurstudier visade att många pro-inflammatoriska cytokiner är uppreglerat i mus decidua under förlossningen, såsom TNF-a, IL-6, IL-12 och IL-1b12. I den mänskliga decidua uppvisar pro-inflammatoriska cytokiner IL-1b, IL-6 och IL-8 (stora neutrofila korrektiv) högre uttryck under förlossningen jämfört inte i labor13. Dessa utsöndras cytokiner leder till en aktivering och tillströmningen av leukocyter i den decidual vävnader14; en ökning av decidual makrofag och neutrofil infiltration i både mänskliga och råtta ses under benämna arbete, med decidual infiltration föregår myometrium 4-fold större, vilket indikerar en kaskad av aktivering mellan denna två intilliggande uterin vävnader 15. dessa infiltrera leukocyter producerar PGs kan aktivera synkron sammandragningar av myometriet16, matrix metalloproteinaser (MMP) att inleda membran brista17,18, samt Pro-inflammatoriska cytokiner att förstärka uterin aktiveringsprocessen (‘cytokin storm’).
På grund av många viktiga funktioner i decidual celler, som spelar en avgörande roll i implantationsprocessen, upprätthålla mödra-fetal tolerans i tidig dräktighet och deltar i aktiveringen av arbetskraft på sikt, kan olika sjukdomar uppstå under graviditet. Till exempel kan (1) infertilitet på grund av återkommande implantation misslyckande och återkommande missfall resultera i ett misslyckande av decidual mognad; (2) intrauterin tillväxt begränsning (Genanalys) och havandeskapsförgiftning på grund av felaktig utveckling och dysfunktion av decidua/moderkakan eller komprometterad vaskulär omvandling vid decidual-myometrium korsningen; samt (3) prematur förlossning vilket kan resultera från tidig decidual aktivering.
Mot bakgrund av dessa stora störningar, tillsammans med de etiska och praktiska begränsningarna av mänskliga i vivo studier, om inrättande av primära mänskliga decidual cellinjer är viktigt för in vitro- analys med syfte att bättre förstå och att förbättra klinisk behandling av komplikationer under graviditeten. Därför var syftet med vår forskning att utveckla ett protokoll som möjliggör för isolering av mänskliga primära decidual celler med hög cell avkastning och lönsamhet som samlats in från fostrets hinnor av termen efterbörd. Här aktuella protokollet tydligt beskriver en tid – och cost effective metod för isolering av specifika subtyper av decidual celler som ska användas för en mängd olika in vitro- analyser. Karakterisering av överflödet och fenotyp av decidual delpopulation på sikt och jämförelse till första och andra trimestern är avgörande för att definiera deras roller i hela mänskliga dräktigheten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet beskrivs här visar en kostnad och tid effektiv metod för att isolera primära decidual celler som samlats in från fostrets membranen i hela den mänskliga termen efterbörd som är mycket tillgängliga och okomplicerad. Framgången med detta protokoll är beroende av två kritiska faktorer, (1) effektiviteten i decidual skrapa från chorion lagret av fostrets membran och (2) vård som hanteras de decidual cellerna i hela protokollet. Det är viktigt att chorion vävnad kontaminering kontrolleras genom att …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka givarna, RCWIH biobanken, och Mount Sinai Hospital/UHN avdelningen för obstetrik och gynekologi för de mänskliga prover som används i denna studie. Vi skulle vilja tacka ledamöterna i lut labbet, särskilt Dr Caroline Dunk för hennes hjälp med metodutvecklingen. Detta arbete stöds av Burroughs Välkommen fonden (grant #1013759).
Materials
| Hank’s balanced salt solution with calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Hank’s balanced salt solution without calcium and magnesium | Prepared in facility (LTRI) | ||
| Diaper pads | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Large surgical scissors | AL Medical | 2018-12-20. | |
| Large surgical forceps | Fine Science Tools | 11000-18 | |
| Plastic disposable cell scraper (25 cm) | Sarstedt | 83.183 | |
| 250 mm (size 60 mesh) metal sieve | Sigma-Aldrich | S1020-5EA | |
| Disposable scalpel with plastic handle (#21) | Fisher Scientific | 08-927-5D | |
| Sterile plastic petri dish (diameter 10 cm) | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sterile specimen container (urine cup, 4.5 oz) | VWR | 25384-146 | |
| Nylon filter (70 mm) | VWR/Corning | 21008-952 | |
| Erythrocyte lysis buffer | Qiagen | 79217 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Lonza | 17-942E | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Hemocytometer | Reichert | 1490 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 culture media | Invitrogen | 11835-055 | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 080-150 | |
| Normocin (50mg/ mL) | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Plastic top filtration unit (0.22 mm membrane, 500 mL) | Millipore | SCGPT05RE | |
| Collagenase 2, lyophilized powder | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| Soy bean trypsin inhibitor, powder | Sigma-Aldrich | T9003-250mg | |
| DNase powder | Roche | 10104159001 | |
| Bovine serum albumin (BSA powder) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Spinning disc confocal microscope – Leica DMI 6000B | Leica | ||
| Imaging Flow cytometer – Image Stream MK2 | Amnis | ||
| IDEA software | Millipore Sigma | ||
| APC-conjugated Vimentin antibody | R&D Systems | IC2105A | |
| APC H7-conjugated CD45 antibody | BD | 641399 | |
| FITC-conjugated Cytokeratin antibody | MACs Miltenyi Biotec | 130-080-101 | |
| PerCP -conjugated Cytokeratin 7 antibody | Novus | NBP2-47941PCP | |
| eFluor450 Fixable Viability dye | Thermo Fisher Scientific | 65-0863-14 | |
| Vimentin primary antibody | Santa Cruz | sc-7558 | |
| CD45 primary antibody | Dako | M0701 | |
| Cytokeratin primary antibody | Dako | M0821 | |
| Cytokeratin 7 primary antibody | Dako | M7018 | |
| Mouse IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| Goat IgG | Santa Cruz | sc-2028 | |
| Alexa Fluor 546 secondary antibody | Invitrogen | A10036 | |
| Alexa Fluor 594 secondary antibody | Fisher Scientific | A-11058 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
References
- Brosens, N., Hayashi, N., White, J. O. Progesterone receptor regulates decidual prolactin expression in differentiating human endometrial stromal cells. Endocrinology. 140, 4809-4820 (1999).
- Bell, S. C., D’Arcangues, C., Frase, I. S., Newton, J. R., Odlind, V. . Decidualization and relevance to menstruation. , 187-212 (1990).
- Kariya, M. Interleukin-1 inhibits in vitro decidualization of human endometrial stromal cells. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 73, 1170-1174 (1991).
- Dimitriadis, E., Robb, L., Salamonsen, L. A. Interleukin 11 advances progesterone-induced decidualization of human endometrial stromal cells. Molecular and Human Reproduction. 8, 636-643 (2002).
- Wu, W. -. X., Brooks, J., Glasier, A. F., McNeilly, A. S. The relationship between decidualization and prolactin mRNA and production at different stages of human pregnancy. Society for Endocrinology. 14, 255-261 (1995).
- Bell, S. C. Synthesis and secretion of protein by the endometrium and decidua. Implantation: Biology and Clinical Aspects. , 95-118 (1988).
- Croy, B. A., Chantakru, S., Esadeg, S., Ashkar, A. A., Wei, Q. Decidual natural killer cells: key regulators of placental development. Journal of Reproductive Immunology. 57, 151-168 (2002).
- Smarason, A. K., Gunnarsson, A., Alfredsson, J. H., Valdimarsson, H. Monocytosis and monocytic infiltration of decidua in early pregnancy. Journal of Clinical and Laboratory Immunology. 21, 1-5 (1986).
- Daiter, E., Pampfer, S., Yeung, Y. G., Barad, D., Stanley, E. R., Pollard, J. W. Expression of colony- stimulating factor-1 in the human uterus and placenta. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 74, 850-858 (1992).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Beutler, B., Milewich, L., MacDonald, P. C. Cachectin/tumor necrosis factor-alpha formation in human decidua. Potential role of cytokines in infection-induced preterm labor. Journal of Clinical Investigation. 83, 430-436 (1989).
- Lala, P. K., Kennedy, T. G., Parhar, R. S. Suppression of lymphocyte alloreactivity by early gestational human decidua. II. Characterization of the suppressor mechanisms. Cellular Immunology. 127, 368-381 (1988).
- Shynlova, O., Nedd-Roderique, T., Li, Y., Dorogin, A., Nguyen, T., Lye, S. J. Infiltration of myeloid cells into decidua is a critical early event in the labour cascade and post-partum uterine remodelling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17, 311-324 (2013).
- Osman, I., Young, A., Ledingham, M. A., Thomson, A. J., Jordan, F., Greer, I. A., Norman, J. E. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Molecular Human Reproduction. 9, 41-45 (2003).
- Farine, T., Lye, S. J., Shynlova, O. Peripheral maternal leukocytes are activated in response to cytokines secreted by uterine tissues of pregnant women. Journal of Cellular and Molecular Immunology. 14, 635-638 (2017).
- Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biology of Reproduction. 86, 39 (2011).
- Casey, M. L., Cox, S. M., Word, A., Macdonald, P. C. Cytokines and infection-induced preterm labour. Reprodution Fertility and Development. 2, 499-510 (1990).
- Yellon, S. M., Mackler, A. M., Kirby, M. A. The role of leukocyte traffic and activation in parturition. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 10, 323-338 (2003).
- Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. S., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cellular & Molecular Immunology. 11, 571-581 (2014).
- Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface. Journal of Visualized Experiments. 99, (2015).
- Trundley, T., Gardner, L., Northfield, J., Moffett, A. Methods for isolation of cells from the human fetal-maternal interface. Methods in Molecular Medicine. 122, 109-122 (2006).
- Jividen, K., Movassagh, M. J., Jazaeri, A., Li, H. Two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens. Journal of Visualized experiments. 87, (2014).
- Pelekanos, R. A., Sardesai, V. S., Futrega, K., Lott, W. B., Kuhn, M., Doran, M. R. Isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue. Journal of Visualized experiments. 112, (2016).
- De Clercq, K., Hennes, A., Vrien, J. Isolation of mouse endometrial epithelial and stromal cells for in vitro decidualization. Journal of Visualized Experiments. 121, (2017).
- Zhang, J., Shynlova, O., Sabras, S., Bang, A., Briollais, L., Lye, S. J. Immunophenotyping and activation status of maternal and peripheral blood leukocytes during pregnancy and labour, both term and preterm. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10, 2386-2402 (2017).
