Identificación del Receptor de dopamina D1-alfa en roedores núcleo Accumbens por una innovador ARN In Situ la tecnología de detección
Summary
Identificación del receptor de dopamina D1-alfa en el Núcleo accumbens es fundamental para clarificar la disfunción del receptor D1 durante una enfermedad del sistema nervioso central. Se realizó un análisis para un RNA nuevo en situ hibridación para visualizar solo moléculas de ARN en un área específica del cerebro.
Abstract
En el sistema nervioso central, el receptor del subtipo de D1-alfa (Drd1α) es el receptor más abundante de dopamina (DA), que desempeña un papel vital en la regulación del desarrollo y el crecimiento neuronal. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a las anormalidades del receptor Drd1α mediar las respuestas del comportamiento y la modulación de la función de memoria de trabajo aún no están claros. Usando un análisis nuevo RNA en situ el hibridación, el estudio actual identificado dopamina Drd1α del receptor y la tirosina hidroxilasa (TH) RNA expresión de circuitos relacionados con la DA en el Núcleo accumbens (NAc) área y región de nigra del substantia (SNR), respectivamente. Expresión de Drd1α en el NAc muestra un “punto discreto” patrón de tinción. Se observaron diferencias de sexo claro en la expresión de Drd1α. Por el contrario, TH muestra un patrón de coloración “cluster”. En cuanto a la expresión de TH, ratas hembra muestran una mayor expresión de la señal por la célula en relación con los animales masculinos. Los métodos presentados aquí ofrecen una técnica novedosa en situ hibridación para investigar cambios en la disfunción del sistema dopamina durante la progresión de enfermedades del sistema nervioso central.
Introduction
Disfunción del sistema de dopamina estriatal está implicada en la progresión de los síntomas clínicos observados en múltiples enfermedades neurocognitivas. Los receptores D1 de dopamina están presentes en la corteza prefrontal (PFC) y regiones estriadas del cerebro y fuertemente influyen en procesos cognitivos1, incluyendo memoria, el procesamiento temporal y comportamiento locomotor2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. estudios anteriores aclaran que los cambios de los receptores de dopamina D1 se asocian con la progresión de atención e hiperactividad déficit trastorno (TDAH)8, los síntomas neurocognitivos en la esquizofrenia9, 10 y estrés sensibilidad11. Específicamente, en la esquizofrenia, estudios de tomografía por emisión de positrones (PET) indican que la capacidad de unión de los receptores D1 de dopamina en las cortezas prefrontales muy fue relacionado con déficit cognoscitivo y la presencia de síntomas negativos11. El crecimiento dendrítico de las neuronas excitatorias de la corteza prefrontal, regulado por el receptor de dopamina D1 alivia la susceptibilidad al estrés biológico. Además, la caída del receptor D1 en las neuronas corticales prefrontal medial (mPFC) podría mejorar la derrota social evitación social inducida por estrés12.
Aquí, presentamos una nueva técnica de RNA en situ hibridación para visualizar solo moléculas de ARN en una célula con las muestras de tejido fresco congelado. La presente técnica tiene varias ventajas sobre los métodos que existen en la literatura actual. En primer lugar, el procedimiento actual conserva el contexto espacial y morfológico de los tejidos y se realizó en muestras de tejido fresco congelado para que otros procedimientos que requieren la fresca, los tejidos no incrustados pueden combinarse con los métodos actuales. Procedimientos similares en los tejidos fijados con formol y embebido en parafina han ilustrado que resolución de transcripción solo se puede conseguir usando una RNA en situ hibridación técnica13. Detección de RNA en el nivel de transcripción solo ofrece una sensibilidad superior a baja copia número expresión así como la oportunidad de comparar la expresión génica a nivel de células individuales que no pueden lograrse por otros métodos de detección de ácidos nucleicos, como técnicas de reacción en cadena (PCR) polimerasa. Además, el método actual mantiene imágenes con un alto cociente signal-to-noise a través de sondas muy específicas de RNA que son hibridadas de las transcripciones del RNA solo objetivo y secuencialmente vinculadas con una cascada de moléculas de amplificación de señal en la detección sistema. Finalmente, la tecnología actual ofrece la oportunidad de evaluar varios sistemas biológicos con sus sondas propietarias específico del destino, en lugar de limitar nuestra investigación a sólo una clase de marcadores relacionados con el sistema tales como la detección de proteínas por métodos de inmunohistoquímica.
En nuestro estudio, utilizamos esta novela RNA en situ hibridación para evaluar Drd1α la expresión del receptor en el Núcleo accumbens (NAc) y la tirosina hidroxilasa (TH) expresión en el nigra del substantia (SNR) de ratas de F344/N machos y hembras. La innovadora RNA en situ hibridación nos permitió investigar los mecanismos que influyen en la absorción DA y DA liberación simultáneamente, mejorando nuestra comprensión de la complejidad del sistema estriado DA. Aquí, describimos el procedimiento para el cerebro congelado rodajas y proporcionar métodos de análisis de datos para diferentes patrones de tinción: “punto discreto” o “clusters”.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, describimos una nueva técnica de hibridación en situ para rebanadas de cerebro congelado evaluar Drd1α la expresión del receptor en el Núcleo accumbens (NAc) y la expresión de tirosina hidroxilasa (TH) en la región de nigra del substantia (SNR). También ofrecemos métodos de análisis de datos para diferentes patrones de tinción: “punto discreto” o “clusters”.
Los pasos críticos para un ensayo de fluorescencia multiplex éxito RNA en situ hibridac…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los presentes trabajos fueron apoyados por los institutos nacionales de subvenciones de salud (NIH) HD043680, MH106392, DA013137 y NS100624. Fondo parcial fue proveído por una beca de formación de NIH T32 en ciencia biomédica y de conducta.
Materials
| HybEZ Oven system | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe – Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Color channel 1, Green |
| RNAscope Probe – Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Color channel 2, Orange |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 slide rack | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek staining dish | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision General Purpose Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| ProLong Gold anti-fade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | parts of kits |
| EZ-C1 software package | Nikon Instruments | version 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | version 9.4 |
References
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