שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa
Summary
שיטות פשוטות מתוארים על הפגנת הייצור של amyloids ציטוטוקסיות בעקבות זיהום של אנדותל ריאתי על ידי Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
חולים ששרדו דלקת ריאות רוממתם שיעורי התמותה בחודשים שלאחר השחרור החולים. זה היה שיערו כי דלקת של רקמת הריאה במהלך דלקת ריאות תוצאות בייצור של cytotoxins חיים ארוכים זה יכול להוביל לכשל איברים סיום עוקבות. פיתחנו במבחנה מבחני כדי לבדוק את ההשערה כי cytotoxins מיוצרים במהלך זיהום ריאתי. תאי אנדותל הריאות עכברוש מבודד, החיידק Pseudomonas aeruginosa משמשים מודל מערכות, והפגינו הייצור של cytoxins בעקבות זיהום של תאי אנדותל על ידי החיידקים היא באמצעות תרבית תאים ואחריו כימות ישירה באמצעות מבחני לקטט דהידרוגנאז שיטה מיקרוסקופיים ניצול טכנולוגיית ImageJ. מהות עמילואיד cytotoxins האלה הודגם על ידי מבחני הכריכה T thioflavin על ידי immunoblotting ו- immunodepletion באמצעות נוגדן נגד עמילואיד A11. ניתוחים נוספים באמצעות immunoblotting הפגינו טאו oligomeric ו- Aβ המיוצר ושוחרר על ידי תאי אנדותל בעקבות זיהום aeruginosa פ. שיטות אלה צריך להיות בקלות להתאמה ניתוחים של דגימות קליניות אנושי.
Introduction
חולים ששרדו דלקת ריאות. רוממתם שיעורי התמותה בחודשים שלאחר החולים פריקה1,2,3,4,5,6. ברוב המקרים, מוות מתרחשת על ידי סוג של כשל איברים סוף כולל כליות, ריאות, לב, או אירועים הכבד, כמו גם קו5,6. הסיבה שיעור התמותה גבוה באוכלוסיית חולים זו מעולם לא נקבעה.
דלקת ריאות מסווג כ להיות גם הקהילה רכשה או רכשה החולים (nosocomial), סוכנים שיכולים לגרום לדלקת ריאות כוללים חיידקים, וירוסים, פטריות וכימיקלים. אחד הגורמים העיקריים של דלקת ריאות nosocomial הוא החיידק Pseudomonas aeruginosa. Aeruginosa פ הוא אורגניזם גראם שליליים המשתמשת מערכת הפרשת סוג III להעברת מולקולות אפקטור שונים, הנקרא exoenzymes, ישירות אל הציטופלסמה של היעד תאים7,8. במהלך זיהום של תאי אנדותל הריאות, exoenzymes המטרה חלבונים תאיים שונים, לרבות צורת אנדותל הקשורים microtubule חלבון טאו9,10,11,12 , המוביל אל המכשול אנדותל התמוטטות וכתוצאה מכך בצקת ריאות חמורה, ירד תפקוד ריאתי ומוות, לעיתים קרובות,.
כאמור, חולים ששרדו ריאות הראשונית רוממתם שיעורי התמותה ב-12 החודשים הראשונים לאחר הפרשות חולים. מנגנון פוטנציאליים על ההסבר לתופעה זו הוא כי סוג כלשהו של רעל מאריכים נוצר במהלך זיהום ראשוני שמוביל לתוצאות המסכן. שתי תצפיות תומכים האפשרות הזו. ראשית, בתרבית ריאתי אנדותל תאים שטופלו בתחילה aeruginosa פ להיכשל להתרבות במשך שבוע לאחר החיידקים מומתים על ידי אנטיביוטיקה13. שנית, מאריכים prions וסוכנים עם מאפיינים פריון הוכחו מחלות האדם ושל בעלי החיים השונים, בעיקר מחלות הקשורות למערכת העצבים ה-14,15.
שיטות לבחינת פוטנציאל הייצור של סוכנים ציטוטוקסיות חיים ארוכים במהלך זיהום ריאתי לא תוארו. כאן סדרה של מבחני פשוטה במבחנה מתוארים שניתן להשתמש בו עבור חוקרים cytotoxin ייצור ופעילות בעקבות זיהום באמצעות סוכן גורם משותף דלקת ריאות, aeruginosa פ. מבחני אלה צריך להיות להתאמה בקלות לחקור אינדוקציה cytotoxin אפשרי בעקבות זיהום באמצעות חומרים אחרים הגורמים לדלקת ריאות, supernatants שנוצרו גם צריך להיות שימושי עבור חוקרים תופעות של cytotoxins כולה איברים או בעלי חיים. בסופו של דבר, מבחני המפורטות כאן ככל הנראה תהיה יכולת הסתגלות כדי לבדוק נוזלים ביולוגיים בעלי חיים ועל האדם לייצור cytotoxins במהלך דלקת ריאות.
Protocol
Representative Results
Discussion
. הנה, שיטות פשוטות במבחנה מתוארים אשר מאפשרים הפגנה של הדור של amyloids ציטוטוקסיות במהלך זיהום עם דלקת ריאות גורמת האורגניזם. שיטות אלה כוללים תא תרבות cytotoxicity assay, immunoblotting, כימות של תא להרוג באמצעות שיטת מיקרוסקופיים הרומן, ThT מחייב. ניתוחים של הסוכנים ציטוטוקסיות הוכיחו כי הם עמילואיד ב?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן חלקים על ידי NIH מענקים HL66299 TS, RB ו SL, HL60024 ל TS, HL136869 ל MF.
Materials
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man’s friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
