Pseudomonas aeruginosa द्वारा फुफ्फुसीय Endothelial कोशिकाओं के संक्रमण के बाद साइटोटोक्सिक Amyloids का पता लगाने के लिए तरीके
Summary
सरल तरीके Pseudomonas aeruginosaद्वारा फुफ्फुसीय endothelium के संक्रमण के बाद साइटोटोक्सिक amyloids के उत्पादन का प्रदर्शन करने के लिए वर्णित हैं ।
Abstract
रोगियों जो निमोनिया बच अस्पताल के निर्वहन के बाद के महीनों में मौत की दर को बुलंद किया है । यह कल्पना की गई है कि निमोनिया के दौरान फेफड़े के ऊतकों के संक्रमण के उत्पादन में लंबे समय तक रहने वाले cytotoxins कि बाद के अंत अंग विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हम इन विट्रो परख में विकसित किया है परिकल्पना है कि cytotoxins फुफ्फुसीय संक्रमण के दौरान उत्पादित कर रहे है परीक्षण । पृथक चूहा फेफड़े के endothelial कोशिकाओं और जीवाणु Pseudomonas aeruginosa मॉडल सिस्टम के रूप में उपयोग किया जाता है, और cytoxins कोशिकाओं के जीवाणुओं द्वारा निंनलिखित संक्रमण के उत्पादन के बाद सेल संस्कृति का उपयोग करके प्रदर्शित होता है प्रत्यक्ष quantitation का उपयोग कर स्तनपान डिहाइड्रोजनेज परख और एक उपंयास सूक्ष्म ImageJ प्रौद्योगिकी का उपयोग विधि । इन cytotoxins के amyloid स्वभाव को thioflavin टी बाइंडिंग परख कर और immunoblotting और immunodepletion का प्रयोग करके A11 विरोधी amyloid एंटीबॉडी द्वारा प्रदर्शित किया गया. इसके अलावा विश्लेषण का उपयोग immunoblotting का प्रदर्शन किया है कि oligomeric ताऊ और Aβ का उत्पादन किया गया और endothelial कोशिकाओं द्वारा aeruginosaद्वारा संक्रमण के बाद जारी । इन तरीकों मानव नैदानिक नमूनों का विश्लेषण करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय होना चाहिए ।
Introduction
रोगियों को जो निमोनिया बच अस्पताल निर्वहन1,2,3,4,5,6के बाद के महीनों में मौत की दर बुलंद है । ज्यादातर मामलों में, मृत्यु गुर्दे, फेफड़े, हृदय, या जिगर की घटनाओं, साथ ही स्ट्रोक5,6सहित अंत अंग विफलता के कुछ प्रकार से होता है । इस रोगी की आबादी में ऊंचा मृत्यु दर का कारण कभी नहीं स्थापित किया गया है ।
निमोनिया या तो समुदाय अधिग्रहीत किया जा रहा है या अस्पताल-अधिग्रहीत (nosocomial) के रूप में वर्गीकृत है, और निमोनिया पैदा कर सकता है एजेंटों बैक्टीरिया, वायरस, कवक, और रसायनों शामिल हैं । nosocomial निमोनिया के प्रमुख कारणों में से एक जीवाणु Pseudomonas aeruginosaहै । P. aeruginosa एक ग्राम-नकारात्मक जीव है जो विभिन्न प्रभाव वाले अणुओं को हस्तांतरित करने के लिए एक प्रकार III स्राव प्रणाली का उपयोग करता है, exoenzymes के लिए, सीधे लक्ष्य कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य करने के लिए7,8. फुफ्फुसीय endothelial कोशिकाओं के संक्रमण के दौरान, exoenzymes लक्ष्य विभिन्न intracellular प्रोटीन, microtubule के एक endothelial फार्म सहित-जुड़े प्रोटीन ताऊ9,10,11,12 , endothelial बाधा टूटने के लिए अग्रणी गंभीर फुफ्फुसीय शोफ में जिसके परिणामस्वरूप, फेफड़े के कार्य में कमी आई है और, अक्सर, मौत ।
जैसा कि पहले कहा, रोगियों जो प्रारंभिक निमोनिया बच अस्पताल के निर्वहन के बाद पहले 12 महीनों में मौत की दर ऊंचा कर दिया है । इस घटना को समझाने के लिए एक संभावित तंत्र है कि लंबे समय तक रहने वाले विष के कुछ प्रकार के प्रारंभिक संक्रमण है कि गरीब दीर्घकालिक परिणाम की ओर जाता है के दौरान उत्पन्न होता है. दो अवलोकन इस संभावना का समर्थन करते हैं । पहले, aeruginosa के साथ शुरू में इलाज कर रहे है कि कल्चरल पल्मोनरी endothelial कोशिकाओं के लिए पैदा करना करने के लिए एक सप्ताह के बाद असफल बैक्टीरिया13एंटीबायोटिक दवाओं द्वारा मारे गए हैं । दूसरा, लंबे समय तक रहते थे prions और prion विशेषताओं के साथ एजेंटों विभिन्न मानव और पशु रोगों में प्रदर्शन किया गया है, विशेष रूप से तंत्रिका तंत्र के साथ जुड़े रोगों14,15.
फेफड़े के संक्रमण के दौरान लंबे समय तक रहने वाले साइटोटोक्सिक एजेंटों के संभावित उत्पादन की जांच के लिए तरीके कभी नहीं बताया गया है । यहां सरल की एक श्रृंखला इन विट्रो परख में उल्लिखित है कि cytotoxin उत्पादन और गतिविधि के बाद एक आम एजेंट के कारण निमोनिया का उपयोग कर संक्रमण की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, पी aeruginosa। इन परख आसानी से संभव cytotoxin प्रेरण अंय एजेंटों का उपयोग कर संक्रमण के बाद की जांच करने के लिए अनुकूलनीय होना चाहिए कि कारण निमोनिया, और supernatants कि उत्पंन कर रहे है भी cytotoxins के प्रभाव की जांच के लिए उपयोगी होना चाहिए पूरे में अंगों या जानवरों । अंत में, परख है कि यहां उल्लिखित है सबसे अधिक संभावना निमोनिया के दौरान cytotoxins के उत्पादन के लिए पशु और मानव जैविक तरल पदार्थ का परीक्षण करने के लिए अनुकूल हो जाएगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, सरल इन विट्रो विधियों में उल्लिखित जो एक निमोनिया के कारण जीव के साथ संक्रमण के दौरान साइटोटोक्सिक amyloids की पीढ़ी के प्रदर्शन की अनुमति देते हैं । इन तरीकों एक सेल संस्कृति cytotoxicity परख, immunoblotting, सेल के …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अनुसंधान के भागों में NIH अनुदान HL66299 टीएस, आरबी, और SL, HL60024 से टीएस के लिए वित्त पोषित किया गया था, और MF को HL136869 ।
Materials
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
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