Metoder for å oppdage cytotoksisk Amyloids følgende infeksjon av lunge endotelceller av Pseudomonas aeruginosa
Summary
Enkle metoder er beskrevet for å vise produksjonen av cytotoksisk amyloids etter smitte av lunge endotelet av Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pasienter som overlever lungebetennelse har forhøyede dødelighet i månedene etter sykehus utslipp. Det har vært en teori om at infeksjon av lunge vev under lungebetennelse resulterer i produksjon av langvarige cytotoxins som kan føre til etterfølgende slutten organ dårlig. Vi har utviklet i vitro analyser for å teste hypotesen at cytotoxins blir produsert i lunge smitte. Isolert rotte lunge endotelceller og bakterien Pseudomonas aeruginosa brukes som modellsystemer, og produksjonen av cytoxins etter smitte av endotelceller av bakterier er demonstrert med cellekultur etterfulgt av direkte kvantifisering laktat dehydrogenase analyser og romanen mikroskopiske metode bruker ImageJ teknologien. Amyloid natur disse cytotoxins ble demonstrert ved thioflavin T bindende analyser og ved immunoblotting og immunodepletion bruker A11 anti-amyloid antistoff. Videre analyser ved hjelp av immunoblotting har vist at oligomeric tau og Aβ ble produsert og utgitt av endotelceller etter infeksjon av P. aeruginosa. Disse metodene bør være lett tilpasses analyser av menneskelige kliniske prøver.
Introduction
Pasienter som overlever lungebetennelse har forhøyede dødelighet i månedene etter sykehus utslipp1,2,3,4,5,6. I de fleste tilfeller oppstår død av noen type end-orgel svikt inkludert nyre, lunge, hjerte, eller lever hendelser, samt slag5,6. Årsaken til opphøyet dødsraten i denne pasienten befolkningen har aldri blitt etablert.
Lungebetennelse er klassifisert som blir enten markedsstøtte ervervet eller sykehus-ervervet (nosocomial) og agenter som kan forårsake lungebetennelse inneholde bakterier, virus, sopp og kjemikalier. En av hovedårsakene til nosocomial lungebetennelse er bakterien Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa er en gram-negative organisme som bruker en type III sekresjon system for å overføre ulike effektor molekyler, kalt exoenzymes, direkte til cytoplasma målet celler7,8. Under infeksjon av lunge endotelceller målrette exoenzymes ulike intracellulær proteiner, inkludert en endothelial form for microtubule-assosiert protein tau9,10,11,12 , fører til endotelial barriere sammenbrudd resulterer i alvorlige lungeødem, redusert pulmonal funksjon og ofte død.
Som nevnt tidligere, har pasienter som overlever første lungebetennelse forhøyede dødelighet i de første 12 månedene etter sykehus utslipp. En potensiell mekanisme for å forklare fenomenet er at noen form for varige gift genereres under den opprinnelige infeksjonen som fører til dårlig langsiktige utfallet. To observasjoner støtter denne muligheten. Første, kultivert lunge endotelceller som behandles først med P. aeruginosa ikke sprer opptil en uke etter at bakterier blir drept av antibiotika13. Sekund, lang levetid prioner og agenter med prion egenskaper har blitt vist i ulike mennesker og dyr sykdommer, spesielt sykdommer forbundet med nervesystemet14,15.
Metoder for å undersøke potensielle produksjonen av varige cytotoksiske agenter under lunge infeksjon har aldri blitt beskrevet. Her en rekke enkle i vitro analyser er beskrevet som kan brukes for å undersøke cytotoxin produksjon og aktivitet etter infeksjon med en vanlig lungebetennelse forårsaker agent, P. aeruginosa. Disse analyser bør være lett tilpasses å undersøke mulige cytotoxin induksjon etter infeksjon med andre agenter som forårsaker lungebetennelse, og supernatants som genereres også bør være nyttig for å undersøke effekten av cytotoxins helt organer eller dyr. Endelig, analyser som er skissert her mest sannsynlig vil være tilpasningsdyktige teste dyr og menneskelige biologiske væsker for produksjon av cytotoxins under lungebetennelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her utdypes enkel i vitro metodene som tillater demonstrasjon av generasjon cytotoksisk amyloids under infeksjon med en lungebetennelse forårsaker organisme. Disse metodene omfatter en celle kultur cytotoksisitet analysen, immunoblotting, kvantifisering av cellen drap med en roman mikroskopiske metode, og ThT bindende. Analyser av cytotoksiske agenter har vist at de er amyloid i naturen (figur 2 og Figur 4) og vise egenskapene til en…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble finansiert i deler av NIH tilskudd HL66299 TS, RB og SL, HL60024 til TS og HL136869 til MF.
Materials
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man’s friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
