Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa
Summary
Métodos simples são descritos para demonstrar a produção de amiloides citotóxicos após infecção do endotélio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pacientes que sobrevivem a pneumonia tem elevadas taxas de mortalidade nos meses após a alta hospitalar. Isso tem sido a hipótese de que a infecção do tecido pulmonar durante uma pneumonia resulta na produção de citotoxinas long-lived que podem levar ao fracasso subsequente fim órgão. Nós desenvolvemos em vitro ensaios para testar a hipótese que citotoxinas são produzidas durante a infecção pulmonar. As células endoteliais pulmonar isolado de rato e a bactéria Pseudomonas aeruginosa são usados como sistemas modelo, e a produção de cytoxins após a infecção das células endoteliais por bactérias é demonstrada usando cultura de células, seguida por quantificação directa utilizando ensaios de lactato desidrogenase e um novo método microscópico utilizando tecnologia ImageJ. A natureza amiloide destas citotoxinas foi demonstrada por ensaios de thioflavin T obrigatórios e immunoblotting e immunodepletion usando anticorpo antiamilóide de A11. Novas análises usando immunoblotting demonstraram que tau oligoméricas e Aβ foram produzidos e liberados por células endoteliais após infecção por p. aeruginosa. Esses métodos devem ser facilmente adaptávelas para análises de amostras clínicas humanas.
Introduction
Pacientes que sobrevivem a pneumonia tem elevadas taxas de mortalidade nos meses seguintes hospital descarga1,2,3,4,5,6. Na maioria dos casos, a morte ocorre por algum tipo de falha final-órgão, incluindo renais, pulmonares, cardíacas, ou eventos de fígado, bem como derrame5,6. A razão para a elevada taxa de mortalidade nesta população de pacientes nunca foi estabelecida.
Pneumonia é classificada como também sendo adquirida na Comunidade ou hospitalar (nosocomial) e agentes que podem causar pneumonia incluem bactérias, vírus, fungos e substâncias químicas. Uma das principais causas de pneumonia nosocomial é a bactéria Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa é um organismo Gram-negativo que usa um sistema de secreção do tipo III para transferir várias moléculas efetoras, denominadas exoenzymes, diretamente para o citoplasma das células de destino7,8. Durante a infecção de células endoteliais pulmonares, os exoenzymes alvo várias proteínas intracelulares, incluindo um formulário endotelial do microtubule-associada da proteína tau9,10,11,12 , levando à desagregação de barreira endotelial, resultando em edema pulmonar grave, diminuição da função pulmonar e, muitas vezes, morte.
Como dito anteriormente, pacientes que sobrevivem a pneumonia inicial elevaram taxas de mortalidade nos primeiros 12 meses após a alta hospitalar. Um mecanismo potencial para explicar esse fenômeno é que algum tipo de toxina long-lived é gerado durante a infecção inicial que conduz ao pobre resultado a longo prazo. Duas observações suportam esta possibilidade. Em primeiro lugar, culturas pulmonares células endoteliais, que são tratadas inicialmente com p. aeruginosa falharem a proliferar por até uma semana depois que as bactérias são mortas por antibióticos13. Segundo, long-lived priões e agentes com características de príon foram demonstrados em várias doenças humanas e animais, particularmente doenças associadas com o sistema nervoso de14,15.
Nunca têm sido descritos métodos para analisar o potencial de produção de agentes citotóxicos long-lived durante a infecção pulmonar. Aqui uma série de ensaios simples em vitro são descritos que podem ser usados para investigar cytotoxin produção e actividade após infecção usando um comum agente causando uma pneumonia, p. aeruginosa. Estes ensaios devem ser facilmente adaptávelas para investigar indução cytotoxin possível após infecção usando outros agentes que causam a pneumonia, e os sobrenadantes são gerados também devem ser útil para investigar os efeitos dos citotoxinas no todo órgãos ou animais. Finalmente, os ensaios que são descritos aqui provavelmente será adaptávelas para testar os fluidos biológicos humanos e animais para a produção de citotoxinas durante uma pneumonia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, simples em vitro métodos estão descritos que permitem a demonstração da geração de amiloides citotóxicas durante a infecção com uma organismo causador de pneumonia. Estes métodos incluem um ensaio de citotoxicidade de cultura de células, immunoblotting, quantificação de célula usando um novo método microscópico e ThT vinculação a matar. Análises dos agentes citotóxicos têm demonstrado que eles são amiloide na natureza (Figura 2 e <stron…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada em partes por subvenções de NIH HL66299 TS, RB e SL, HL60024 de TS e HL136869 para MF.
Materials
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
References
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