الأسفار التصوير المقطعي الجزيئية للتصوير في فيفو لتكثيفها جليوبلاستوما
Summary
قد استخدمت الحقن داخل الجمجمة أورثوتوبيك الخلايا السرطانية في أبحاث السرطان لدراسة البيولوجيا ورم الدماغ والتقدم والتطور والاستجابة العلاجية. نقدم هنا fluorescence الجزيئية التصوير المقطعي لتكثيفها الورم، الذي يوفر التصوير إينترافيتال في الوقت الحقيقي والتحديد الكمي للورم الشامل في نماذج جليوبلاستوما الإكلينيكية.
Abstract
توموريجينيسيتي هو قدرة الخلايا السرطانية على تكوين ورم الجماهيري. نهج مستخدمة على نطاق واسع لتحديد ما إذا كانت الخلايا الورمية بالفئران العوز بالحقن تحت الجلد مع الخلايا السرطانية وقياس كتلة الورم بعد أن تصبح مرئية وملموسة. حقن أورثوتوبيك الخلايا السرطانية تهدف إلى إدخال إكسينوجرافت في المكروية يشبه الأنسجة الأصلية للورم وتجري دراسة أوثق. ويتطلب أبحاث سرطان الدماغ داخل الجمجمة حقن الخلايا السرطانية للسماح بتشكيل الورم والتحليل في المكروية فريدة من نوعها للدماغ. التصوير في فيفو تكثيفها داخل الجمجمة يرصد على الفور كتلة الورم أورثوتوبيكالي انجرافتيد الفئران. هنا نحن تقرير استخدام fluorescence الجزيئية التصوير المقطعي (FMT) لتكثيفها ورم الدماغ. أولاً ترانسدوسيد بالقرب من البروتينات الفلورية الأشعة تحت الحمراء الخلايا السرطانية وحقن ثم في دماغ الفئران المناعة. ثم يتم فحص الحيوانات الحصول على معلومات كمية عن كتلة الورم على مدى فترة ممتدة من الوقت. خلية قبل وسم يسمح للقياس الكمي استنساخه، فعالة من حيث التكلفة وموثوق بها من عبء الورم داخل كل الماوس. علينا التخلص من الحاجة إلى حقن ركازات التصوير، وبالتالي تخفيض الضغط على الحيوانات. ويمثل حد من هذا النهج بعدم القدرة على الكشف عن الجماهير صغيرة جداً؛ ومع ذلك، فقد قرار أفضل للجماهير أكبر من غيرها من التقنيات. يمكن تطبيقها لتقييم فعالية العلاج من تعاطي المخدرات أو التعديلات الوراثية لخطوط الخلايا الدبقي والعينات المستمدة من المريض.
Introduction
السرطان واحد من الأسباب الرئيسية للوفيات الناجمة عن المرض في البشر في العالم الصناعي. مع الوفيات مرتفعة للغاية، علاجات جديدة مطلوبة على وجه الاستعجال. جليوبلاستوما عديدة الأشكال (GBM) نوع الغاية فتاكة سرطان الدماغ، تتألف من السكان غير المتجانسة للورم، اللحمية، ومحصنة من خلايا المخ. وفقا للتسجيل ورم “الدماغ المركزي” للولايات المتحدة الأمريكية، الإصابة بأورام الدماغ الخبيثة وغير الخبيثة الأولية حوالي 22 حالة كل 100 ألف. من المتوقع أن يتم تشخيصها في الولايات المتحدة الأمريكية في عام 20171حوالي 000 11 قضية جديدة.
الدراسات الإكلينيكية التحقيق في احتمال المخدرات أو الإجراء، أو العلاج أن يكون فعالاً قبل إجراء التجارب على البشر. واحدة من الخطوات مختبر أقرب في الدراسات الإكلينيكية على تحديد أهداف جزيئية المحتملة للعلاج من تعاطي المخدرات باستخدام الخلايا السرطانية التي زرعها في أحد الكائنات المضيفة، تعريفها كنماذج إكسينوجرافت البشرية. وفي هذا السياق، ورم الدماغ داخل الجمجمة xenograft نماذج استخدام تكثيفها المستمدة من المريض (بدكسس) قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة البيولوجيا ورم الدماغ والتقدم والتطور والاستجابة العلاجية، وفي الآونة الأخيرة لتطوير المؤشرات الحيوية، المخدرات الفرز، وشخصية الطب2،،من34.
واحدة من أكثر بأسعار معقولة وغير الغازية في فيفو التصوير أساليب رصد تكثيفها داخل الجمجمة هو الإضاءة الحيوية التصوير (BLI)5،6،،من78. ومع ذلك، تتضمن بعض القيود BLI الإدارة الركيزة وتوافر واستقرار الإنزيم، وتبريد الخفيفة والتشتت أثناء التصوير اقتناء9. هنا نحن تقرير FMT الأشعة تحت الحمراء كبديل التصوير أسلوب رصد نماذج جليوبلاستوما الإكلينيكية. في هذا الأسلوب، والحصول على إشارة والتحديد الكمي بدكسس إينتراكرانيالي مزروع، معربا عن بروتين القريبة من الأشعة تحت الحمراء فلورسنت iRFP72010،11 (يطلق عليها من الآن فصاعدا ك FP720) أو turboFP635 (يطلق عليه من الآن فصاعدا ك FP635)، تتم مع معاهدة المواد الانشطارية نظام التصوير. استخدام تكنولوجيا إنتاج المواد الانشطارية، أورثوتوبيك الأورام يمكن رصدها في فيفو قبل أو أثناء أو بعد العلاج، بطريقة غير الغازية، وخالية من الركازة، والكمية للملاحظات الإكلينيكية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تكثيفها الورم وقد استخدمت على نطاق واسع في أبحاث السرطان، وقد تم وضع عدد من تقنيات التصوير الراسخة: BLI؛ الرنين المغناطيسي التصوير (التصوير بالرنين المغناطيسي)؛ بوزيترون التصوير المقطعي (PET)، حسبت التصوير المقطعي (CT)؛ معاهدة المواد الانشطارية. كل من هذه النهوج ويأتي مع إيجابيات وسلبيات، بل ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور فريدريك لانغ، MD مركز أندرسون للسرطان للخليج للحاسبات الآلية-PDX نيوروسفيريس. وأيده هذا العمل “هزيمة GBM البحوث التعاونية”، تابعة “الدماغ ورم في المجتمع الوطني” (فرانك فورناري)، R01-NS080939 (فرانك فورناري)، مؤسسة ماكدونيل. س. جيمس (فرانك فورناري)؛ وأيده خورخي بينيتيز تحكيم من أمريكا الدماغ ورم رابطة (حلقات)؛ وأيد زانكا سيرو جزئيا زمالة بحثية ما بعد الدكتوراه “مؤسسة مكافحة السرطان” الأمريكية-الإيطالية. فرانك فورناري يتلقى المرتبات وتوفير دعم إضافي من معهد لودفيج “أبحاث السرطان”.
Materials
| DMEM/High Glucose | HyClone/GE | SH30022.1 | |
| DMEM/F12 1:1 | Gibco | 11320-082 | |
| FBS | HyClone/GE | SH30071.03 | |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
| Trypsin | HyClone/GE | SH30236.01 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| human recombinant EGF | Stemcell Technologies | 2633 | |
| human recombinant FGF | Stemcell Technologies | 2634 | |
| DPBS | Corning | 21-031-00 | |
| FACS tubes | Falcon | 352235 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Blasticidin | ThermoFisher Scientific | A1113903 | |
| p24 ELISA | Clontech | 632200 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Ketamine | Zoetis | NADA 043-403 | Controlled substance |
| Ointment | Dechron | NDC 17033-211-38 | |
| Absorbable suture | CpMedical | VQ392 | |
| 5 ul syringe | Hamilton | 26200-U | Catalog number as sold by Sigma-Aldrich |
| Cell Sorter | Sony | SH8007 | |
| Mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730 | |
| Motorized stereotaxic injector | Stoelting | 53311 | |
| Micromotor hand-held drill | Foredom | K1070 | |
| Mouse warming pad | Ken Scientific Corporation | TP-22G | |
| Fluorescence Tomography System | PerkinElmer | FMT 2500 XL | |
| TrueQuant Imaging Software | Perkin Elmer | 7005319 | |
| Ultra-centrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | 392049 | |
| Tissue Culture 100mm Dishes | Olympus Plastics | 25-202 | |
| Tissue Culture 150mm Dishes | Olympus Plastics | 25-203 | |
| Tissue Culture Flasks T75 | Corning | 430720U | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430290 | |
| 15 mL conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Centrifuge Avanti J-20 | Beckman Coulter | J320XP-IM-5 | |
| Tube, Polypropylene, Thinwall, 5.0 mL | Beckman Coulter | 326819 | |
| Tube, Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 (Homozygous) | Prior approval by the Institutional Animal Care Program and by the Institutional Biosafety Committee required. |
References
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS Statistical Report: Primary Brain and Other Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2009-2013. Neuro-Oncology. 18 (suppl_5), v1-v75 (2016).
- Pauli, C., et al. Personalized In Vitro and In Vivo Cancer Models to Guide Precision Medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Stewart, E. L., et al. Clinical Utility of Patient-Derived Xenografts to Determine Biomarkers of Prognosis and Map Resistance Pathways in EGFR-Mutant Lung Adenocarcinoma. Journal of Clinical Oncology. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nat Med. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (41), e1986 (2010).
- Kondo, A., et al. An experimental brainstem tumor model using in vivo bioluminescence imaging in rat. Child’s Nervous System. 25 (5), 527-533 (2009).
- Nyati, S., Young, G., Ross, B. D., Rehemtulla, A., Kozlov, S. V. . ATM Kinase: Methods and Protocols. , 97-111 (2017).
- Kondo, A., et al. Longitudinal assessment of regional directed delivery in a rodent malignant glioma model. J Neurosurg Pediatr. 4 (6), 592-598 (2009).
- Badr, C. E., Badr, C. E. . Bioluminescent Imaging: Methods and Protocols. , 1-18 (2014).
- Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat Meth. 10 (8), 751-754 (2013).
- Filonov, G. S., et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat Biotech. 29 (8), 757-761 (2011).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protocols. 1 (1), 241-245 (2006).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Benitez, J. A., et al. PTEN regulates glioblastoma oncogenesis through chromatin-associated complexes of DAXX and histone H3.3. Nature Communications. 8, 15223 (2017).
- Kirschner, S., et al. Imaging of Orthotopic Glioblastoma Xenografts in Mice Using a Clinical CT Scanner: Comparison with Micro-CT and Histology. PLOS ONE. 11 (11), e0165994 (2016).
- Mannheim, J. G., et al. Standardization of Small Animal Imaging-Current Status and Future Prospects. Molecular Imaging and Biology. , (2017).
- Engblom, C., et al. Osteoblasts remotely supply lung tumors with cancer-promoting SiglecFhigh neutrophils. Science. 358 (6367), (2017).
- Lauber, D. T., et al. State of the art in vivo imaging techniques for laboratory animals. Laboratory Animals. 51 (5), 465-478 (2017).
- Zanca, C., et al. Glioblastoma cellular cross-talk converges on NF-κB to attenuate EGFR inhibitor sensitivity. Genes & Development. 31 (12), 1212-1227 (2017).
- Villa, G. R., et al. An LXR-Cholesterol Axis Creates a Metabolic Co-Dependency for Brain Cancers. Cancer Cell. 30 (5), 683-693 (2016).
- Liu, F., et al. EGFR Mutation Promotes Glioblastoma through Epigenome and Transcription Factor Network Remodeling. Molecular Cell. 60 (2), 307-318 (2015).
