JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Bio-ingénierie

Vurdering af kollagen og Elastin pres-afhængige Microarchitectures i Live, menneskelige modstand arterierne af Label-fri Fluorescens mikroskopi

Published: April 09, 2018
doi:
10.3791/57451
, , ,
1Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine,University of Southern Denmark, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology,University of Southern Denmark, 3Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery,Odense University Hospital

Summary

Vi beskriver samtidige mekanisk testning og 3D-billedbehandling af arterievæggen af isolerede, levende menneskelige modstand arterier og Fiji og Ilastik billede analyser til kvantitativ bestemmelse af elastin og kollagen rumlige organisation og volumen tætheder. Vi diskuterer brugen af disse data i matematiske modeller af arterievæggen mekanik.

Abstract

Patogene bidrag modstand arterie remodellering er dokumenteret i essentiel hypertension, diabetes og det Metaboliske syndrom. Undersøgelser og udvikling af microstructurally motiveret matematiske modeller til at forstå de mekaniske egenskaber af menneskelige modstand arterier i sundhed og sygdom har potentiale til at støtte forståelse hvordan sygdom og medicinsk behandlinger påvirke den menneskelige mikrocirkulationen. For at udvikle disse matematiske modeller, er det vigtigt at afkode forholdet mellem de mekaniske og mikroarkitektonisk egenskaber af mikrovaskulære væggen. I dette arbejde beskriver vi en ex vivo metode for passiv mekanisk testning og samtidige etiket-fri tredimensional billeddannelse af mikroarkitektur elastin og kollagen i arterievæggen af isolerede menneskelige modstand arterier. Imaging protokollen kan anvendes til modstand arterier af alle arter af interesse. Billede analyser er beskrevet for kvantificering i) Tryk-inducerede ændringer i indre elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rethed ved hjælp af Fiji og ii) kollagen og elastin volumen tætheder bestemmes ved hjælp af Ilastik software. Helst alle mekaniske og billedbehandling målingerne udføres på live, perfunderet arterier, men en alternativ tilgang ved hjælp af standard video-mikroskopi pres blodkar i kombination med efter fiksering billeddannelse af re trykisoleret fartøjer er drøftet. Denne alternative metode giver brugere med forskellige muligheder for analyse tilgange. Medtagelsen af de mekaniske og billeddiagnostiske data i matematiske modeller af arterievæggen mekanik er drøftet, og fremtidige udvikling og tilføjelser til protokollen er foreslået.

Introduction

Patogene bidrag og effekter af modstand arterie remodellering er dokumenteret i essentiel hypertension, diabetes og det Metaboliske syndrom1,2,3,4,5. Afkodning af forholdet mellem den mekaniske og mikroarkitektonisk egenskaber af mikrovaskulære væggen er afgørende for udviklingen af matematiske modeller af denne tilknytning. Sådanne modeller vil forbedre forståelsen af remodeling proces og vil støtte udviklingen af siliciummangan modeller nyttig ved afprøvning af farmakologiske strategier rettet mod sygdom relateret remodellering af arterievæggen.

Forudgående undersøgelser fokuseret i forståelsen af hvordan mikroarkitektur af arterievæggen vedrører arterievæggen mekanik ved at indarbejde mekaniske foranstaltninger og mikroarkitektur af den ekstracellulære matrix (ECM) er næsten udelukkende udført på store , elastisk conduit arterier fra mus eller svin6,7,8,9,10,11. Billeddannelse af mikrostrukturer af væggen er typisk udføres ved hjælp af ulineære optiske teknikker, at drage fordel af autofluorescence af elastin og anden harmonisk generation af kollagen. Dette giver mulighed for spatiotemporelle billeddannelse af de to vigtigste komponenter i den ekstracellulære matrix, elastin og kollagen, uden behov for farvning. Billeddannelse af arterievæggen i fuld tykkelse er en udfordring i store conduit arterierne på grund af scatter af lyset i den tykke tunica media. For at bestemme, hvordan mikroarkitektur af de strukturelle komponenter af arterievæggen vedrører de observerede mekaniske egenskaber, skal tre-dimensionelle oplysninger indhentes i løbet af den mekaniske test. For store arterier som menneskelige aorta kræver dette biaksiale montering, mekanisk prøvning og imaging af regioner af interesse i 1-2 cm2 stykker af arterievæggen7,9,10, 12. kun en del af væggen kan være afbildet og mekanisk testet.

For mindre arterier af enhver art (f.eks. menneskelige perikardial13, pulmonal14 og subkutane15 arterier, rotte mesenteriallymfeknuderne arterier16,17,18, 19 , 20, mus cremaster, mesenteriallymfeknuderne, cerebral, collum og halspulsårer21,22,23,24,25,26, 27) billeddannelse af hele vægtykkelse er muligt og kan være kombineret med mekaniske test. Dette giver mulighed for simultan optagelse af de mekaniske egenskaber og de strukturelle ordninger inden for muren. Imidlertid er en direkte matematisk modellering af forholdet mellem de observerede ændringer i de tre-dimensionelle struktur af ECM og ændrede mekaniske egenskaber af arterievæggen modstand til bedst af vores viden kun blevet rapporteret efter for nylig i menneskernes modstand arterier13,15.

I dette arbejde, er en ex vivo metode for passiv mekanisk testning og samtidige tredimensional billeddannelse af mikroarkitektur elastin og kollagen i arterievæggen af isolerede menneskelige modstand arterier beskrevet. Imaging protokollen kan anvendes til modstand arterier af alle arter af interesse. Billede analyser er beskrevet for at opnå indre elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rethed13 ved hjælp af Fiji28. Kollagen og elastin volumen tætheder bestemmes ved hjælp af Ilastik software29 og endelig optagelse af den mekaniske og billeddiagnostiske data i matematiske modeller af arterievæggen mekanik er diskuteret.

Mål at beskrive billedbehandling og image analyserne teknikker i kombination med matematisk modellering er at give efterforskere en systematisk tilgang til at beskrive og forstå observeret induceret trykændringer i ECM af modstand arterier. Den beskrevne metode er fokuseret i kvantificere ændringer i ECM i en beholder under opretholdelse, tryk i hovedbrandledningssystemet ved at sammenligne struktur af ECM på 20, 40 og 100 mmHg. Disse pres blev valgt til at bestemme strukturen af arterievæggen på sin mere kompatibel (20 mmHg), stiv (100 mmHg) og (40 mmHg) mellemtilstand, henholdsvis. Imidlertid kan enhver proces i det vaskulære mur af levende arterier, herunder ændringer foranlediget af vasoaktive komponenter, hysterese og flow, kvantificeres, afhængigt af den forskning hypotese pågældende investigator.

Brugen af to-foton excitation Fluorescens mikroskopi (TPEM) i kombination med et tryk myograph for at studere pres (eller andre) induceret ændringer i ECM af levende arterier er understreget. Først, fordi det giver mulighed for samtidig erhvervelse af den samlede tre-dimensionelle struktur af arterievæggen (diameter og væg tykkelse) sammen med tre-dimensionelle etiket-fri erhvervelse af høj kvalitet, detaljerede billeder af kollagen og elastin microarchitectures som beskrevet13 ved at udnytte autofluorescence elastin og kollagen anden harmonisk generation signal (SHG)30. Andet, TPEM giver mulighed for brug af lavenergi-nær-infrarødt excitations lys, minimere solskader af væv og dermed gentagne imaging på præcis den samme position indenfor den vaskulære væg er tilladt, tillader det gentagne målinger analyser af observerede ændringer.

Brug af en alternativ tilgang ved hjælp af Konfokal billeddannelse af presset fast arterier diskuteres for at tillade brugere uden adgang til TPEM en mulighed for at anvende den beskrevne metode. Oplysninger om ECM struktur og volumen tætheder kan også hentes fra to-dimensionelle analyser af væv sectioned i serie, f.eks. som beskrevet af31,32. På grund af manglende mulighed for at hente tre-dimensionelle strukturelle oplysninger over længdeskalaer af arterie og under skiftende betingelser ved hjælp af denne metode, er det imidlertid ikke anbefale at bruge denne fremgangsmåde for undersøgelser af pres og behandling induceret tre-dimensionelle ændringer i ECM.

Mindstekravet til investigator at anvende den heri beskrevne metode er adgang til en opsætning for cannulation og opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet af arterier i kombination med en Konfokal eller to-foton excitation fluorescens mikroskop. Konfigurationen som beskrevet i følgende protokol er en specialbygget presset myograph med en langsgående krafttransducer, bygget til at passe på en brugerdefineret bygget inverteret to-foton excitation fluorescens mikroskop.

Protocol

Samling af biopsier af menneskelige parietal hjertesækken til brug i dette arbejde blev udført efter skriftlig informeret samtykke, som tidligere beskrevet33. Studiet af menneskelige væv i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen34 og blev godkendt af det regionale udvalg for sundhed Research etik for Syddanmark (S-20100044 og S-20140202) og Dansk Data Protection Agency. 1. indsamle væv og isolat (Human) modstand arterie <o…

Representative Results

Den specialbyggede pres myograph for billeddannelse anvendes i dette arbejde er vist i figur 1. Særlig opmærksomhed til design af myograph blev til i) kammer med en lille mængde (2 mL) og ii) mulighed for positionering kanyler tæt på og parallel med glas bund (figur 1B). Kammerets bund passer en 50 × 24 mm #1.5 glas coverslip (udskiftelig). Pres controller blev bygget fra en standard 1 L glasflaske og en blodtryksmaaler (ma…

Discussion

Dette arbejde repræsenterer vores forslag til en standardiseret, kombinerede imaging og pres blodkar tilgang, værdifulde for samtidige vurdering af de mekaniske egenskaber af modstand arterier og pres-relaterede ændringer i strukturen af arteriel væggen over et pres fra 0 til 100 mmHg. Den præsenterede tilgang blev udviklet ved hjælp af brugerdefinerede indbygget udstyr, dog kan ethvert pres myograph, der passer på en to-foton excitation fluorescens mikroskop bruges, når udformningen af både udstyr giver billedd…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takke Dansk Molekylær biomedicinsk Imaging Center på Det Naturvidenskabelige Fakultet, Syddansk Universitet, til brug i laboratorier og mikroskoper. Kristoffer Rosenstand og Ulla Melchior er anerkendt for fremragende teknisk bistand med presset blodkar og billedbehandling.

Materials

Fine Science Tools 15401-12
Fine Science Tools 11251-23
Nikon SMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 761028 for dissection purpose
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark 1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
Ethicon Ethilon 11-0
Custom built DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark 1.00496.9010 Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. 1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific 10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK 538944
Nikon Custom built
Spectra Physics, Mountain View, CA
Nikon CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
Nikon CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, Denmark H7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). Chroma ET402/15X 
Scotch TM
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
  2. Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
  3. van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
  4. Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
  5. Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
  6. Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
  7. Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
  8. Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
  9. Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
  10. Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
  11. Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
  12. Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
  13. Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
  14. Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
  15. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  16. Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
  17. Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
  18. Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
  19. Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
  21. Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
  22. Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
  23. Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
  24. Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
  25. Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
  26. Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
  27. Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. , 230-233 (2011).
  30. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
  31. Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
  32. Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
  33. Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients’ Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
  34. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  37. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  38. Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
  39. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  40. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
  41. Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
  42. Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
  43. Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
  44. Fung, Y. C. . Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , (1993).
  45. Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
  46. VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
  47. Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
  48. Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
  49. Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
  50. Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
  51. Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
  52. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
  53. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).

Tags

CollagenElastinMicroarchitectureResistance ArteriesLabel-free Fluorescence MicroscopyTwo-photon MicroscopyExtracellular MatrixVascular MechanicsArtery PressurizationSecond Harmonic GenerationAutofluorescenceFiji Image Analysis
check_url/fr/57451?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bloksgaard, M., Thorsted, B., Brewer, J. R., De Mey, J. G. R. Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (134), e57451, doi:10.3791/57451 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image