Vi beskriver samtidige mekanisk testning og 3D-billedbehandling af arterievæggen af isolerede, levende menneskelige modstand arterier og Fiji og Ilastik billede analyser til kvantitativ bestemmelse af elastin og kollagen rumlige organisation og volumen tætheder. Vi diskuterer brugen af disse data i matematiske modeller af arterievæggen mekanik.
Patogene bidrag modstand arterie remodellering er dokumenteret i essentiel hypertension, diabetes og det Metaboliske syndrom. Undersøgelser og udvikling af microstructurally motiveret matematiske modeller til at forstå de mekaniske egenskaber af menneskelige modstand arterier i sundhed og sygdom har potentiale til at støtte forståelse hvordan sygdom og medicinsk behandlinger påvirke den menneskelige mikrocirkulationen. For at udvikle disse matematiske modeller, er det vigtigt at afkode forholdet mellem de mekaniske og mikroarkitektonisk egenskaber af mikrovaskulære væggen. I dette arbejde beskriver vi en ex vivo metode for passiv mekanisk testning og samtidige etiket-fri tredimensional billeddannelse af mikroarkitektur elastin og kollagen i arterievæggen af isolerede menneskelige modstand arterier. Imaging protokollen kan anvendes til modstand arterier af alle arter af interesse. Billede analyser er beskrevet for kvantificering i) Tryk-inducerede ændringer i indre elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rethed ved hjælp af Fiji og ii) kollagen og elastin volumen tætheder bestemmes ved hjælp af Ilastik software. Helst alle mekaniske og billedbehandling målingerne udføres på live, perfunderet arterier, men en alternativ tilgang ved hjælp af standard video-mikroskopi pres blodkar i kombination med efter fiksering billeddannelse af re trykisoleret fartøjer er drøftet. Denne alternative metode giver brugere med forskellige muligheder for analyse tilgange. Medtagelsen af de mekaniske og billeddiagnostiske data i matematiske modeller af arterievæggen mekanik er drøftet, og fremtidige udvikling og tilføjelser til protokollen er foreslået.
Patogene bidrag og effekter af modstand arterie remodellering er dokumenteret i essentiel hypertension, diabetes og det Metaboliske syndrom1,2,3,4,5. Afkodning af forholdet mellem den mekaniske og mikroarkitektonisk egenskaber af mikrovaskulære væggen er afgørende for udviklingen af matematiske modeller af denne tilknytning. Sådanne modeller vil forbedre forståelsen af remodeling proces og vil støtte udviklingen af siliciummangan modeller nyttig ved afprøvning af farmakologiske strategier rettet mod sygdom relateret remodellering af arterievæggen.
Forudgående undersøgelser fokuseret i forståelsen af hvordan mikroarkitektur af arterievæggen vedrører arterievæggen mekanik ved at indarbejde mekaniske foranstaltninger og mikroarkitektur af den ekstracellulære matrix (ECM) er næsten udelukkende udført på store , elastisk conduit arterier fra mus eller svin6,7,8,9,10,11. Billeddannelse af mikrostrukturer af væggen er typisk udføres ved hjælp af ulineære optiske teknikker, at drage fordel af autofluorescence af elastin og anden harmonisk generation af kollagen. Dette giver mulighed for spatiotemporelle billeddannelse af de to vigtigste komponenter i den ekstracellulære matrix, elastin og kollagen, uden behov for farvning. Billeddannelse af arterievæggen i fuld tykkelse er en udfordring i store conduit arterierne på grund af scatter af lyset i den tykke tunica media. For at bestemme, hvordan mikroarkitektur af de strukturelle komponenter af arterievæggen vedrører de observerede mekaniske egenskaber, skal tre-dimensionelle oplysninger indhentes i løbet af den mekaniske test. For store arterier som menneskelige aorta kræver dette biaksiale montering, mekanisk prøvning og imaging af regioner af interesse i 1-2 cm2 stykker af arterievæggen7,9,10, 12. kun en del af væggen kan være afbildet og mekanisk testet.
For mindre arterier af enhver art (f.eks. menneskelige perikardial13, pulmonal14 og subkutane15 arterier, rotte mesenteriallymfeknuderne arterier16,17,18, 19 , 20, mus cremaster, mesenteriallymfeknuderne, cerebral, collum og halspulsårer21,22,23,24,25,26, 27) billeddannelse af hele vægtykkelse er muligt og kan være kombineret med mekaniske test. Dette giver mulighed for simultan optagelse af de mekaniske egenskaber og de strukturelle ordninger inden for muren. Imidlertid er en direkte matematisk modellering af forholdet mellem de observerede ændringer i de tre-dimensionelle struktur af ECM og ændrede mekaniske egenskaber af arterievæggen modstand til bedst af vores viden kun blevet rapporteret efter for nylig i menneskernes modstand arterier13,15.
I dette arbejde, er en ex vivo metode for passiv mekanisk testning og samtidige tredimensional billeddannelse af mikroarkitektur elastin og kollagen i arterievæggen af isolerede menneskelige modstand arterier beskrevet. Imaging protokollen kan anvendes til modstand arterier af alle arter af interesse. Billede analyser er beskrevet for at opnå indre elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rethed13 ved hjælp af Fiji28. Kollagen og elastin volumen tætheder bestemmes ved hjælp af Ilastik software29 og endelig optagelse af den mekaniske og billeddiagnostiske data i matematiske modeller af arterievæggen mekanik er diskuteret.
Mål at beskrive billedbehandling og image analyserne teknikker i kombination med matematisk modellering er at give efterforskere en systematisk tilgang til at beskrive og forstå observeret induceret trykændringer i ECM af modstand arterier. Den beskrevne metode er fokuseret i kvantificere ændringer i ECM i en beholder under opretholdelse, tryk i hovedbrandledningssystemet ved at sammenligne struktur af ECM på 20, 40 og 100 mmHg. Disse pres blev valgt til at bestemme strukturen af arterievæggen på sin mere kompatibel (20 mmHg), stiv (100 mmHg) og (40 mmHg) mellemtilstand, henholdsvis. Imidlertid kan enhver proces i det vaskulære mur af levende arterier, herunder ændringer foranlediget af vasoaktive komponenter, hysterese og flow, kvantificeres, afhængigt af den forskning hypotese pågældende investigator.
Brugen af to-foton excitation Fluorescens mikroskopi (TPEM) i kombination med et tryk myograph for at studere pres (eller andre) induceret ændringer i ECM af levende arterier er understreget. Først, fordi det giver mulighed for samtidig erhvervelse af den samlede tre-dimensionelle struktur af arterievæggen (diameter og væg tykkelse) sammen med tre-dimensionelle etiket-fri erhvervelse af høj kvalitet, detaljerede billeder af kollagen og elastin microarchitectures som beskrevet13 ved at udnytte autofluorescence elastin og kollagen anden harmonisk generation signal (SHG)30. Andet, TPEM giver mulighed for brug af lavenergi-nær-infrarødt excitations lys, minimere solskader af væv og dermed gentagne imaging på præcis den samme position indenfor den vaskulære væg er tilladt, tillader det gentagne målinger analyser af observerede ændringer.
Brug af en alternativ tilgang ved hjælp af Konfokal billeddannelse af presset fast arterier diskuteres for at tillade brugere uden adgang til TPEM en mulighed for at anvende den beskrevne metode. Oplysninger om ECM struktur og volumen tætheder kan også hentes fra to-dimensionelle analyser af væv sectioned i serie, f.eks. som beskrevet af31,32. På grund af manglende mulighed for at hente tre-dimensionelle strukturelle oplysninger over længdeskalaer af arterie og under skiftende betingelser ved hjælp af denne metode, er det imidlertid ikke anbefale at bruge denne fremgangsmåde for undersøgelser af pres og behandling induceret tre-dimensionelle ændringer i ECM.
Mindstekravet til investigator at anvende den heri beskrevne metode er adgang til en opsætning for cannulation og opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet af arterier i kombination med en Konfokal eller to-foton excitation fluorescens mikroskop. Konfigurationen som beskrevet i følgende protokol er en specialbygget presset myograph med en langsgående krafttransducer, bygget til at passe på en brugerdefineret bygget inverteret to-foton excitation fluorescens mikroskop.
Dette arbejde repræsenterer vores forslag til en standardiseret, kombinerede imaging og pres blodkar tilgang, værdifulde for samtidige vurdering af de mekaniske egenskaber af modstand arterier og pres-relaterede ændringer i strukturen af arteriel væggen over et pres fra 0 til 100 mmHg. Den præsenterede tilgang blev udviklet ved hjælp af brugerdefinerede indbygget udstyr, dog kan ethvert pres myograph, der passer på en to-foton excitation fluorescens mikroskop bruges, når udformningen af både udstyr giver billedd…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Dansk Molekylær biomedicinsk Imaging Center på Det Naturvidenskabelige Fakultet, Syddansk Universitet, til brug i laboratorier og mikroskoper. Kristoffer Rosenstand og Ulla Melchior er anerkendt for fremragende teknisk bistand med presset blodkar og billedbehandling.
Fine Science Tools | 15401-12 | |
Fine Science Tools | 11251-23 | |
Nikon | SMZ800N | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
Smiths medical Intl, UK | ||
Ethicon | Ethilon 11-0 | |
Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
Mettler toledo | ||
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
Nikon | Custom built | |
Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
Scotch TM | ||
coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |