Vurdere kollagen og Elastin press-avhengige Microarchitectures i Live, menneskelig motstand arterier av etiketten-fri fluorescens mikroskopi
Summary
Vi beskriver samtidig mekanisk testing og 3D-bildebehandling av arterieveggen av isolert, live menneskelig motstand arterier og Fiji og Ilastik bilde analyser for kvantifisering av elastin og kollagen romlig organisering og volum tettheter. Vi diskuterer bruken av disse dataene i matematiske modeller av arterieveggen mekanikk.
Abstract
Patogene bidrag av motstand arterien remodeling dokumentert viktig hypertensjon, diabetes og Metabolsk syndrom. Undersøkelser og utvikling av microstructurally motiverte matematiske modeller for å forstå de mekaniske egenskapene av menneskelig motstand arterier i helse og sykdom har potensial til å hjelpe forstå hvordan sykdommen og medisinske behandlinger påvirke menneskelig blodsirkulasjonen. For å utvikle disse matematiske modeller, er det viktig å dechiffrere forholdet mellom mekanisk og mikroarkitekturstruktur egenskapene til mikrovaskulær veggen. I dette arbeidet beskriver vi en ex vivo metode for passiv mekanisk testing og samtidige etikett-fri tredimensjonale imaging av mikroarkitektur av elastin og kollagen i arterieveggen av isolerte menneskelig motstand arterier. Tenkelig protokollen kan brukes på motstand arterier av alle arter av interesse. Bildet analyser er beskrevet for kvantifisering i) press-indusert endringer i interne elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rett linje ved hjelp av Fiji og ii) kollagen og elastin volum tettheter bestemmes ved hjelp av Ilastik programvare. Fortrinnsvis alle mekaniske og tenkelig mål utføres på live, parfyme arterier, er imidlertid en alternativ tilnærming med standard video-mikroskopi trykk myography i kombinasjon med etter fiksering bildebehandling av nytt trykksatt fartøy diskutert. Denne alternative metoden gir brukerne ulike alternativer for analyse tilnærminger. Inkludering av mekanisk og bildebehandling data i matematiske modeller av arterieveggen mekanikken er diskutert, og fremtidig utvikling og tillegg for protokollen.
Introduction
Patogene bidrag og virkningene av motstand arterien remodeling er dokumentert i viktige hypertensjon, diabetes og Metabolsk syndrom1,2,3,4,5. Tyde forholdet mellom mekanisk og mikroarkitekturstruktur egenskapene til mikrovaskulær veggen er avgjørende for å utvikle matematiske modeller av denne tilknytningen. Slike modeller vil bedre forstå remodeling prosessen og vil støtte utviklingen av sili modeller nyttig for testing av farmakologiske strategier målretting sykdom relatert ombygging av arterieveggen.
Tidligere studier fokuserte forstå hvordan mikroarkitektur av arterieveggen gjelder arterieveggen mekanikk ved å innlemme mekanisk tiltak og mikroarkitektur med den ekstracellulære matrisen (EFM) utføres nesten utelukkende på store , elastisk kanal arterier fra mus eller svin6,7,8,9,10,11. Avbildning av microstructures av veggen utføres vanligvis med lineære optisk teknikker, utnytter autofluorescence av elastin og andre harmonisk generasjon av kollagen. Dette gjør spatiotemporal avbildning av to hovedkomponentene ekstracellulær matrix, elastin og kollagen, uten behov for flekker. Avbildning av arterieveggen full tykkelse er en utfordring i store kanal arterier på grunn av scatter lyset i tykke tunika media. Men for å avgjøre hvordan mikroarkitektur strukturelle komponentene i arterieveggen relatert til de observerte mekaniske egenskapene, må tre-dimensjonal informasjon hentes under mekanisk testing. For store arteriene som menneskelige aorta krever dette biaxial montering, mekanisk testing og imaging regioner av interesse i 1-2 cm2 stykker av arterieveggen7,9,10, 12. kun en del av veggen kan avbildes og mekanisk testet.
For mindre arterier av alle arter (f.eks human perikard13, lunge14 og underhud15 arteriene, rotte hvem arterier16,17,18, 19 , 20, mus cremaster, hvem, cerebral, femur og carotis arteriene21,22,23,24,25,26, 27) bildebehandling av hele veggtykkelse er mulig og kan kombineres med mekanisk testing. Dette tillater samtidig innspillingen av de mekaniske egenskapene og strukturelle avtaler i veggen. Men er en direkte matematisk modellering av forholdet mellom de observerte endringene i tredimensjonale strukturen av ECM og endrede mekaniske egenskaper av motstand arterieveggen, etter beste overbevisning bare rapportert på nylig i menneskelig motstand arterier13,15.
En ex vivo metode for passiv mekanisk testing og samtidige tredimensjonale imaging av mikroarkitektur av elastin og kollagen i arterieveggen av isolerte menneskelig motstand arterier er beskrevet i dette arbeidet. Tenkelig protokollen kan brukes på motstand arterier av alle arter av interesse. Bildet analyser er beskrevet for å få tiltak av interne elastisk lamina forgrening vinkler og adventitial kollagen rett linje13 med Fiji28. Kollagen og elastin volum tettheter fastsettes ved hjelp av Ilastik programvare29 og endelig inkludering av mekanisk og bildebehandling data i matematiske modeller av arterieveggen mekanikken diskuteres.
Målet med beskriver bildebehandling og bilde analysene teknikker i kombinasjon med matematisk modellering er å gi etterforskere en systematical tilnærming for å beskrive og forstå observert press induserte endringer i ECM av motstand arterier. Metoden beskrevet er fokusert i kvantifisere endringene i ECM i et fartøy i pressurization, ved å sammenligne strukturen av ECM på 20, 40 og 100 mmHg. Disse belastningene ble valgt for å bestemme strukturen i arterieveggen i mer kompatibel (20 mmHg), stive (100 mmHg) og mellomstatus (40 mmHg), henholdsvis. Imidlertid kan prosesser i vaskulære veggen av live arteriene, inkludert forandringer indusert av vasoactive komponenter, hysteresis og flyt, kvantifiseres, avhengig av forskning hypotesen aktuelle av utprøver.
Bruk av to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskopi (TPEM) i kombinasjon med et trykk myograph studerer press (eller andre) induserte endringer i ECM live arterier er vektlagt. Først, fordi dette gjør samtidige oppkjøpet av samlet tredimensjonale strukturen i arterieveggen (diameter og veggen tykkelse) sammen med tredimensjonale etikett-fri oppkjøpet av høy kvalitet, detaljerte bilder av kollagen og elastin microarchitectures som beskrevet13 ved å utnytte autofluorescence elastin og kollagen andre harmonisk generasjon signal (SHG)30. Andre tillater TPEM bruk av lavenergi nær infrarød eksitasjon lys, minimere photodamage vev og dermed gjentatte bildebehandling i nøyaktig samme posisjon innenfor vaskulære veggen er tillatt, tillater gjentatte målinger analyser av observert endringer.
Bruk av en alternativ tilnærming med AC confocal imaging press fast arterier er diskutert for å tillate brukere uten tilgang til TPEM en mulighet til å bruke beskrevet metoden også. Informasjon om ECM struktur og volum tettheter kan også hentes fra todimensjonal analyser av vev delt i føljetong, f.eks som beskrevet av31,32. Men på grunn av manglende mulighet til å hente tredimensjonale strukturinformasjon over lengden skalaer av arterien og endre ved hjelp av denne metoden, er det ikke anbefale å bruke denne tilnærmingen for undersøkelser av trykk og behandling indusert tredimensjonale endringer i ECM.
Minimumskravet etterforskeren bruke metoden her beskrevet er tilgang til et oppsett for cannulation og pressurization av arterier i kombinasjon med AC confocal eller to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskop. Beskrevet i følgende protokollen er en spesialbygd press myograph med en langsgående force svinger, bygd for å passe på en tilpasset bygget invertert to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbeidet representerer vårt forslag for en standardisert, kombinert bildebehandling og trykk myography tilnærming, verdifulle samtidige vurdering av de mekaniske egenskapene av motstand arterier og press-relaterte endringer i oppbygning av hovedvei veggen over en trykket varierer fra 0 til 100 mmHg. Presentert tilnærmingen ble utviklet Bruk egendefinerte bygget, men noen press myograph som passer på en to-fotonet eksitasjon fluorescens mikroskop kan brukes når utformingen av både utstyr tillater avbilding av …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker dansk molekylær biomedisinsk bildebehandling sentrum på fakultetet of Natural Sciences, University of Southern Denmark, for bruk av laboratorier og mikroskop. Kristoffer Rosenstand og Ulla Melchior er anerkjent for utmerket kundestøtte med presset myography og bildebehandling.
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
References
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
- van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
- Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
- Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
- Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
- Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
- Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
- Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
- Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
- Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
- Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
- Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
- Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
- Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
- Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
- Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
- Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
- Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
- Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
- Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
- Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
- Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
- Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. , 230-233 (2011).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
- Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients’ Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
- Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
- Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
- Fung, Y. C. . Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , (1993).
- Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
- VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
- Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
- Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
- Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
- Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
- Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).
