Bedömningen av kollagen och Elastin Pressure-dependent Microarchitectures i Live, mänskliga motstånd artärer av etikett-fri fluorescensmikroskopi
Summary
Vi beskriva samtidig mekanisk provning och 3D-imaging i kärlväggen av isolerade, levande mänskliga motstånd artärer, och Fiji och Ilastik image analyser för kvantifiering av elastin och kollagen rumslig organisation och volym tätheter. Vi diskutera användningen av dessa data i matematiska modeller av kärlväggen mekanik.
Abstract
Patogena bidrag motstånd artär remodeling dokumenteras i essentiell hypertoni, diabetes och metabola syndromet. Utredningar och utveckling av microstructurally motiverade matematiska modeller för att förstå de mekaniska egenskaperna av mänskliga motstånd artärerna i hälsa och sjukdom har potential att hjälpa förståelse hur sjukdom och medicinska behandlingar påverka människors mikrocirkulationen. För att utveckla dessa matematiska modeller, är det viktigt att dechiffrera förhållandet mellan mekanisk och mikrostrukturell egenskaperna för mikrovaskulära väggen. I detta arbete beskriver vi en ex vivo -Metod för passiv mekanisk provning och samtidiga etikett-fri tredimensionell avbildning av mikroarkitekturen av elastin och kollagen i kärlväggen av isolerade mänskliga motstånd artärer. Imaging protokollet kan tillämpas på motstånd artärer av alla arter av intresse. Bild analyser beskrivs för att kvantifiera i) tryckinducerad förändringar i intern elastisk lamina förgrenade vinklar och adventitial kollagen rakhet med Fiji och ii) kollagen och elastin volym densiteter fastställs med hjälp av Ilastik programvara. Helst alla mekaniska och imaging mätningar utförs på levande, perfunderade artärer, dock en alternativ metod med standardtryck video-mikroskopi myography i kombination med efter fixering avbildning av nytt trycksatt fartyg är diskuteras. Denna alternativa metod ger användare med olika alternativ för analys metoder. Införandet av mekaniska och tänkbar data i matematiska modeller av kärlväggen mekanikerna diskuteras, och föreslås framtida utveckling och tillägg till protokollet.
Introduction
Det patogena bidrag och effekterna av motstånd artär remodeling dokumenteras i essentiell hypertoni, diabetes och metabola syndromet1,2,3,4,5. Dechiffrera förhållandet mellan mekanisk och mikrostrukturell egenskaperna för mikrovaskulära väggen är viktigt för att utveckla matematiska modeller av denna förening. Sådana modeller kommer att förbättra förstå remodeling processen och kommer att stödja utvecklingen av i silico modeller användbara för att testa farmakologiska strategier inriktning sjukdom relaterade remodeling i kärlväggen.
Tidigare studier fokuserat förstå hur mikroarkitekturen i kärlväggen avser kärlväggen mekanik mekaniska åtgärder och mikroarkitekturen av den extracellulär matrixen (ECM) utförs nästan uteslutande på stora , elastisk conduit artärer från möss eller svin6,7,8,9,10,11. Avbildning av mikrostrukturer av väggen är vanligen utförs med hjälp av olinjära optiska tekniker, utnyttja autofluorescens av elastin och harmonisk understödjautvecklingen av kollagen. Detta tillåter spatiotemporal avbildning av de två viktigaste komponenterna av extracellulärmatrix, elastin och kollagen, utan ett behov för färgning. Avbildning av kärlväggen i full tjocklek är en utmaning i stora conduit artärer tack vare scatteren av ljuset i tjock tunica media. För att avgöra hur mikroarkitekturen strukturella komponenter i kärlväggen avser observerade mekaniska egenskaper, måste dock tredimensionell information fås vid mekanisk provning. För stora artärer som mänskliga aorta kräver detta biaxiell montering, mekanisk provning och avbildning av regioner av intresse i 1-2 cm2 bitar av kärlväggen7,9,10, 12. endast en del av väggen kan avbildas och mekaniskt testade.
För mindre artärer av någon art (t.ex., mänskliga perikardiell13, pulmonell14 och subkutan15 artärer, råtta mesenterica artärer16,17,18, 19 , 20, mus cremaster, mesenteriska, cerebral, femorala och carotid artärer21,22,23,24,25,26, 27) avbildning av hela väggtjockleken är möjligt och kan kombineras med mekanisk provning. Detta tillåter samtidig inspelning av de mekaniska egenskaperna och de strukturella arrangemang inom väggen. Dock rapporterats en direkt matematisk modellering av förhållandet mellan de observerade förändringarna i ECM tredimensionella struktur och ändrade mekaniska egenskaper i kärlväggen motstånd, till bäst av vår kunskap endast vid nyligen i mänskliga motstånd artärer13,15.
I detta arbete beskrivs en ex vivo -Metod för passiv mekanisk provning och samtidiga tredimensionell avbildning av mikroarkitekturen av elastin och kollagen i kärlväggen av isolerade mänskliga motstånd artärer. Imaging protokollet kan tillämpas på motstånd artärer av alla arter av intresse. Bild analyser beskrivs för åtgärder av intern elastisk lamina förgrenade vinklar och adventitial kollagen rakhet13 använda Fiji28. Kollagen och elastin volym tätheter bestäms med Ilastik programvara29 och slutligen införandet av mekaniska och tänkbar data i matematiska modeller av kärlväggen mekanikerna diskuteras.
Målet att beskriva imaging och bild analyserna tekniker i kombination med matematisk modellering är att ge utredarna en systematisk metod för att beskriva och förstå observerat inducerad tryckförändringar i ECM av motstånd artärer. Den beskrivna metoden är fokuserad kvantifiera förändringar i ECM i ett fartyg under trycksättning, genom att jämföra struktur ECM på 20, 40 och 100 mmHg. Dessa tryck valdes för att bestämma strukturen i kärlväggen vid dess mer kompatibel (20 mmHg), stiff (100 mmHg) och mellantillstånd (40 mmHg), respektive. Dock kan någon process i kärlväggen av levande artärer, inklusive ändringar som induceras av vasoaktiva komponenter, hysteres och flöde, kvantifieras, beroende på forskning hypotesen i fråga av prövaren.
Användning av två-photon excitation fluorescensmikroskopi (TPEM) i kombination med en tryck-myograph för studera trycket (eller annan) inducerade förändringar i ECM av levande artärer framhävs. Först, eftersom detta tillåter samtidiga förvärv av den övergripande tredimensionella strukturen i kärlväggen (diameter och väggtjocklek) tillsammans med tredimensionella etikett-gratis förvärv av hög kvalitet, detaljerade bilder av kollagen och elastin microarchitectures som beskrivs13 genom att utnyttja den elastin autofluorescens och kollagen andra harmoniska generation signal (SHG)30. Det andra tillåter TPEM användning av energisnåla infrarött excitation ljus, minimera åldrad hud vävnad och således upprepade imaging på exakt samma position inom kärlväggen är tillåtet, tillåter upprepade-mätningar analyser av observerade förändringar.
Användningen av en alternativ metod som använder confocal avbildning av trycket fast artärer diskuteras så att användare utan tillgång till TPEM en möjlighet att använda den beskrivna metoden också. Information om ECM struktur och volym tätheter kan också hämtas från tvådimensionell analyser av vävnader sektioneras i följetong, e.g. som beskrivs av31,32. På grund av möjligheten att hämta tredimensionella strukturell information via längd skalorna i artären samt under förändrade villkor med hjälp av denna metod, det är dock inte rekommenderar detta tillvägagångssätt för utredningar av tryck och behandling inducerad tredimensionella förändringar i ECM.
Minimikravet för utredaren att tillämpa den häri beskrivna metoden är tillgång till en setup för kanylering och trycksättning av artärerna i kombination med en confocal eller två-photon excitation fluorescens Mikroskop. Den inställning som beskrivs i följande protokoll är en specialbyggd tryck myograph med en längsgående kraftgivare, byggd för att passa på en anpassad inbyggd inverterad två-photon excitation fluorescens Mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta arbete representerar vårt förslag ett standardiserat, kombinerade imaging och trycket myography strategi, värdefullt för samtidig bedömning av de mekaniska egenskaperna hos motstånd artärer och tryck-relaterade förändringar i strukturen av arterial väggen över ett tryckområde från 0 till 100 mmHg. Den presenterade metoden utvecklades med hjälp av anpassade inbyggd utrustning, dock något tryck myograph som passar på en två-photon excitation fluorescens Mikroskop kan användas, när utformningen av b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka danska molekylär medicinsk Imaging centrum vid fakulteten för naturvetenskap, Syddansk Universitet, för användning av laboratorier och Mikroskop. Kristoffer Rosenstand och Ulla Melchior är erkända för utmärkt teknisk hjälp med trycket myography och bildbehandling.
Materials
| Fine Science Tools | 15401-12 | |
| Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Nikon | SMZ800N | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 761028 | for dissection purpose |
| Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark | 1.63, 2.13, 210mm | |
| Smiths medical Intl, UK | ||
| Ethicon | Ethilon 11-0 | |
| Custom built | DK patent number 201200167, University of Southern Denmark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt | |
| Mettler toledo | ||
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | B3259 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | A7030 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | C5670 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | G7021 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | E3889 | |
| Merck Millipore, Hellerup, Denmark | 1.00496.9010 | Phosphate buffered (pH 6.9) 4% formaldehyde solution |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | H3784 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P9666 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | P5655 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | M2643 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S2002 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5886 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | S5761 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | 1.06462 | |
| Gibco, ThermoFisher Scientific | 10010015 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | PHR1423 | |
| Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark. | Z370525 | |
| Tocris Bioscience, Bristol, UK | 538944 | |
| Nikon | Custom built | |
| Spectra Physics, Mountain View, CA | ||
| Nikon | CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27 | |
| Nikon | CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75 | |
| Hamamatsu, Ballerup, Denmark | H7422P-40 | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | ChromaET 460 nm long pass dichroic | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter | |
| AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany). | Chroma ET402/15X | |
| Scotch TM | ||
| coverslip thickness should match used objective on microscope (#1 or #1.5), alternatively, set adjustment collar to match coverslip |
References
- Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
- Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
- van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
- Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
- Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
- Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
- Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
- Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
- Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
- Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001 (2015).
- Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
- Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
- Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
- Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
- Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
- Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
- Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
- Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
- Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108 (2010).
- Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022 (2008).
- Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
- Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
- Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
- Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. , 230-233 (2011).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
- Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
- Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
- Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients’ Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
- Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
- Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
- Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
- Fung, Y. C. . Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , (1993).
- Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998 (2014).
- VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
- Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
- Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
- Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
- Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760 (2013).
- Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111 (2015).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
- Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339 (2017).
