Chromatin looping spiller en viktig rolle i genreguleringen; imidlertid har det vært ingen teknologiske fremskritt som tillate selektiv og reversibel endring av chromatin looper. Her beskriver vi et kraftig system for chromatin loop reorganisering bruker CRISPR-dCas9 (CLOuD9), viste til selektivt og reversibel modulerer genuttrykk på målrettet loci.
Nyere studier har tydelig vist at langtrekkende, tredimensjonal chromatin looping interaksjoner spille en betydelig rolle i regulering av genuttrykk, men om løkker er ansvarlig for eller et resultat av endringer i genuttrykk er fortsatt ukjent. Inntil nylig hvordan chromatin looping påvirker regulering av gen-aktivitet og cellulære funksjoner har vært relativt tvetydig, og begrensninger i eksisterende metoder å manipulere disse strukturene forhindret grundig gjennomgang av disse interaksjoner. For å løse denne usikkerheten, vi utviklet en metode for selektiv og reversibel chromatin loop reorganisering bruker CRISPR-dCas9 (CLOuD9). Dynamikken i CLOuD9 systemet har blitt demonstrert av vellykket lokalisering av CLOuD9 konstruksjoner målrette genomisk loci å modulere lokale chromatin konformasjon. Viktigere, er også muligheten til å reversere indusert kontakten og gjenopprette endogene chromatin konformasjon bekreftet. Av genuttrykk med denne metoden oppretter kapasitet til å regulere cellular genuttrykk og understreker det store potensialet for anvendelser av denne teknologien å skape stabile de novo chromatin looper som påvirker markert gene uttrykk i sammenhenger av kreft og utvikling.
Forholdet mellom chromatin folding i kjernen og bestemt organisasjonen i genomet har fått betydelig interesse i de senere årene, som det har vist seg å være tett forbundet med gene expression1,2. Mens nøyaktig forholdet mellom genet aktivitet og modulering av chromatin struktur er fortsatt uklart, det har vært hypotesen at samspillet mellom chromosomal kontakter som følge av dynamisk tredimensjonale chromatin organisasjon tjene en Gene regelverket3. Faktisk har slik effekt blitt godt demonstrert på menneskelige globin gene locus, der locus kontroll regionen (LCR) regulerer aktiviteten til globin gener i en utviklingsmessig bestemt måte ved å lage en chromatin loop mellom de to regioner4. Men i både denne og andre regioner er det uklart om chromatin løkker er en årsak eller konsekvens av endringer i genuttrykk.
Til nå har forble utfordringene i å studere fenomenet uløste. For eksempel involvert andre forsøk på inducing chromatin looper endrer lineær DNA sekvens eller kompliserte prosedyrer krever en overflod av bakgrunnskunnskap på bestemte elementer som lette looping5,6, 7,8. I tillegg, mens tidligere arbeid har foreslått at chromatin looper stasjonen genuttrykk i en bestemt og begrenset sammenheng7,er8, nivået på chromatin som kontinuerlig påvirker transkripsjon globalt usikker. Om virkningen av langtrekkende løkker på genuttrykk interesse har vokst kontinuerlig gjennom årene, vedvarer ubesvarte spørsmål om etablering og beholde chromatin kontakter for å endre genet aktivitet.
Teknologien som vi har konstruert benytter nuclease mangelfull gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) – CRISPR – forbundet protein 9 (dCas9), for å tillate bredt aktuelt målretting av alle genomic loci9. Denne teknologien eliminerer komplekse knyttet til endringer av lineær DNA sekvensen og er tilgjengelig uten betydelige forkunnskaper bestemt looping komponenter. Mest spesielt, er verktøyet universell og bredt aktuelt til chromatin looper i utvikling så vel som en rekke sykdommer som kreft. Kraften i CLOuD9 er demonstrert av reversibel endrer tabellstrukturen looper å effektivt modulerer genuttrykk.
The Most avgjørende skritt i CLOuD9 chromatin looper er: 1) utforming eller bruker den riktige gRNAs, 2) endre media daglig på CLOuD9-transduced cellene, inkludert ABA eller DMSO 3) opprettholde friskhet av ABA og 4) utfører nøyaktig og nøye vurderinger av chromatin eksteriør.
Grensene for CLOuD9 bor. primært evne til å utforme guider målregion valgfrihet. Guide RNAs utføre den viktige oppgaven å lokalisere dCas9 komponentene til målet DNA områder å være dimerized og effekten av guider er basert på deres spesifikke målområdet. Uten riktig gRNA komponentene indusert CLOuD9 systemet ikke vil kunne danne reversibel looper. Således, ved å utforme flere guider for områder av interesse og spre guider over en region 250-1000 bp, minst en vellykket guide vil være sikret. Guide beliggenheten er også integrert nøyaktige resultater. Det er viktig å unngå guider i transkripsjon faktor bindende områder eller andre kritiske områder for å hindre bakgrunn effekter som opp eller ned regulering av transkripsjon. I tillegg kan nøyaktige plasseringen av den CLOuD9 konstruere litt påvirke transkripsjon av målet genet. Dette understreker viktigheten av å teste flere par av guider for hvert mål område, identifisere mest robuste paret for eksperimentelle formål. Videre, i hvert par Målrett mot regioner, CSA Konstruer bør rettes med gRNAs for S. aureusog CSP Konstruer bør rettes med gRNAs for S. pyogenes for målretting spesifisitet.
For å sikre nøyaktige resultater og riktig dimerization, er det også viktig å opprettholde friskhet av mobilnettet miljøene etter Albin på CLOuD9 konstruksjoner. Daglig media endre og tillegg av fersk dimerizer (eller kontroll) sikrer at de komplementære konstruksjoner vil forbli i nærheten og bevare den endrede chromatin konformasjon. Videre er garanterer ABA er fersk og har vært lagret riktig i henhold til produsentens protokollen (åpnet innen 6 måneder, holdt kaldt, beskyttet fra lys) avgjørende for å oppnå ekte resultater.
Spesielt ble ABA dimerizer for CLOuD9 brukt med ABI og PYL dimerization proteiner, snarere enn mer vanligvis benyttes FRB-og FKBP. Nødvendigheten av en rapalog for FRB/FKBP systemet ville ha begrenset anvendbarhet av CLOuD9, på grunn av giftigheten til kreftceller. Alternative ABI/PYL systemet omgås denne begrensningen, effektivt slik at CLOuD9 skal videre utilizable.
Kollektivt, har vi utviklet CLOuD9, en unik og robust teknologi som tvang men reversibel opprette kontakter mellom langtrekkende mål genomisk loci. Gjennom induserende chromatin looper, viser vi også at CLOuD9 kan brukes til å endre genuttrykk i riktig mobilnettet sammenheng. Tilpasningsevne teknologien tillater ubegrenset studiet av interaksjoner mellom noen to genomisk loci, uten forutgående kunnskap om løkker regioner eller looping mekanismer. I tillegg kan CLOuD9’s unike demonstrert Reversibilitet videre undersøkelse av looping mekanismer i sykdom og utvikling. Mens på mål effektene av chromatin gjentakelse har vist klart, er det ennå ikke data tilbyr innsikt i effekten av off-målet løkker og påfølgende innvirkning på på målet løkkene.
Våre data viser bare noen programmer av dette verktøyet, men innebærer store underliggende ideen at chromatin ordningen er indikativ av genuttrykk. Vår teknologi kan brukes til å studere og avsløre nyansene av chromatin strukturen i genet regulering, og dermed bedre generell forståelse av rollen chromatin folding i transkripsjon av gener. En bedre forståelse av nyanser av transcriptional dynamics kan lede fram i forskning og behandling av kreft, arvelige sykdommer og medfødt lidelser, i som tydelig chromatin montering utvilsomt endrer gene expression20, 21,22,23. Senere arbeidet utnytte CLOuD9 teknologien vil belyse ytterligere detaljer om plasseringen og dynamikken i chromatin domener og hvordan de kjører folding å opprettholde stabil genuttrykk både utvikling og sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo og hele Wang laboratorium for kundestøtte og kritisk lesning av manuskriptet. S.L.M. har vært støttet i dette arbeidet gjennom NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) og National Cancer Institute (1F99CA222541-01). K.C.W. støttes av en Career-pris for medisinske forskere fra Burroughs Wellcome fondet, og er en Donald E. og Delia B. Baxter Foundation fakultetet lærd.
RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | For K562 cell culture |
DMEM media | Life Technologies | 11995-065 | 1X, for 293T cell culture |
lentiCRISPR v2 | Addgene plasmid | #52961 | For CLOuD9 plasmid development |
pRSV-Rev | Addgene plasmid | #12253 | For lentivirus production |
pMD2.G | Addgene plasmid | #12259 | For lentivirus production |
pMDLg/pRRE | Addgene plasmid | #12251 | For lentivirus production |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | For lentivirus production |
anti-HA antibody | Cell Signaling | 3724 | For immunoprecipitation |
anti-Flag antibody | Sigma | F1804 | For immunoprecipitation |
DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For DNA extraction |
TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | For RNA extraction |
RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA extraction |
Superscript VILO | Life Technologies | 11754-050 | For cDNA |
SYBR Green I MasterMix | Roche | 4707516001 | For qPCR analysis |
Light Cycler 480II | Roche | For qPCR analysis | |
anti-H3K4me3 antibody | AbCam | ab8580 | For ChIP-qPCR |
anti-RNA Pol-II antibody | Active Motif | 61083 | For ChIP-qPCR |
EDTA free protease inhibitor | Roche | 11873580001 | For protein extraction |
4-12% Tris Glycine gel | Biorad | Any size, For western blot | |
anti-Rabbit HRP antibody | Santa Cruz | sc-2030 | For western blot |
anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling | 7076S | For western blot |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000AKU | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000APE | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000FCJ | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | GEO | GSM1479215 | For ChIP-seq analysis |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10001D | For immunoprecipitation |
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10004D | For immunoprecipitation |
RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | For RNA purification |
Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | For crosslinking |
PX458 Plasmid | Addgene | 48138 | Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For PCR purification |
FastDigest BsmBI | Thermo Fisher Scientific | FD0454 | For cloning guide RNAs |
FastAP | Thermo Fisher Scientific | EF0651 | For cloning guide RNAs |
10X FastDigest Buffer | Thermo Fisher Scientific | B64 | For cloning guide RNAs |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For cloning guide RNAs |
10X T4 Ligation Buffer | NEB | B0202S | For cloning guide RNAs |
T4 PNK | NEB | M0201S | For cloning guide RNAs |
2X Quick Ligase Buffer | NEB | B2200S | For cloning guide RNAs |
Quick Ligase | NEB | M2200S | For cloning guide RNAs |
Buffers | |||
Farnham lysis buffer | 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water | ||
Modified RIPA buffer | 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4 | ||
IP dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor | ||
Wash buffer | 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate | ||
Swelling buffer | 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40 | ||
Dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl | ||
IP elution buffer | 1% SDS, 10% NaHCO3 |