Kromatin looping spiller en væsentlig rolle i genregulering; der har dog været nogen teknologiske fremskridt, som giver mulighed for selektiv og reversible ændring af kromatin sløjfer. Her beskriver vi et kraftfuldt system for kromatin loop re organisation ved hjælp af CRISPR-dCas9 (CLOuD9), viste at selektivt og reversibelt modulere genekspression på målrettet loci.
Nylige undersøgelser har klart vist at langtrækkende, tre-dimensionelle kromatin looping interaktioner spille en betydelig rolle i reguleringen af genekspression, men om looping er ansvarlig for eller et resultat af ændringer i genekspression er stadig ukendt. Indtil for nylig, hvordan kromatin looping påvirker forordningen af genaktivitet og cellefunktion har været forholdsvis tvetydig, og begrænsninger i eksisterende metoder til at manipulere disse strukturer forhindret tilbundsgående efterforskning af disse interaktioner. For at løse denne usikkerhed, vi udviklet en metode til selektiv og reversible kromatin loop re organisation ved hjælp af CRISPR-dCas9 (CLOuD9). Dynamikken i CLOuD9 systemet er blevet påvist ved vellykket lokalisering af CLOuD9 konstruktioner til at målrette genomisk loci for at modulere lokale kromatin kropsbygning. Evnen til at vende den inducerede kontakt og genoprette den endogene kromatin kropsbygning er vigtigere, også blevet bekræftet. Graduering af genekspression med denne metode fastsætter evne til at regulere cellulær genekspression og understreger den store muligheder for anvendelser af denne teknologi at skabe stabile de novo kromatin sløjfer, der mærkbart påvirker gen udtryk i sammenhænge af kræft og udvikling.
Forholdet mellem kromatin foldning i kernen og den specifikke tilrettelæggelse af genomet har høstet betydelig interesse i de seneste år, som det har vist sig at være nært forbundet med gen expression1,2. Mens den præcise forhold mellem genaktivitet og graduering af kromatin struktur forbliver uklart, det har været en hypotese at samspillet mellem kromosomale kontakter som følge af dynamisk tredimensional kromatin organisation tjene en gen regulativfunktionen3. Ja, sådan en effekt er påvist godt på menneskelige globin gen locus, hvor regionen locus kontrol (LCR) regulerer aktiviteten af globin gener i en udviklingsmæssig specifik måde ved at oprette en kromatin loop mellem to regioner4. Men i både dette og andre områder, det er uklart om kromatin looping er en årsag eller konsekvens af ændringer i genekspression.
Indtil nu har forblev udfordringer i at studere dette fænomen uløst. For eksempel, involveret andre forsøg på overtalelse kromatin sløjfer ændring af lineære DNA sekvens eller komplicerede procedurer kræver en overflod af baggrundsviden om specifikke elementer, som letter looping5,6, 7,8. Derudover, mens tidligere arbejde har foreslået at kromatin loops drev genekspression i en specifik og begrænset forbindelse7,er8, niveauet på hvilke kromatin looping påvirker transskription globalt usikker. Selvom interesse i virkningen af langtrækkende springer på genekspression er vokset konstant i de seneste år, fortsat ubesvarede spørgsmål om oprettelse af og fastholde kromatin kontakter for at ændre genaktivitet.
Den teknologi, som vi har manipuleret beskæftiger nukleasen mangelfuld grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) – CRISPR – forbundet protein 9 (dCas9), at give mulighed for den generelt gældende målretning af enhver genomisk loci9. Denne teknologi eliminerer de komplekse spørgsmål i forbindelse med ændringer af den lineære DNA-sekvens og er tilgængelig uden betydelige forudgående kendskab til særlige looping komponenter. Mest bemærkelsesværdigt, er værktøjet universelle og generelt gælder for kromatin sløjfer anerkendt i udvikling, en lang række sygdomme, såsom kræft. Styrken af CLOuD9 fremgår af reversibelt at ændre strukturen af sløjfer til effektivt modulere genekspression.
The most kritiske trin i CLOuD9 kromatin looping er: 1) designe eller ved hjælp af den korrekte gRNAs, 2) skiftende medier dagligt på CLOuD9-transduced celler, herunder ABA eller DMSO, 3) bevare friskhed af ABA, og 4) udfører præcis og omhyggelige vurderinger af kromatin kropsbygning.
Grænserne for CLOuD9 bor primært i evnen til at designe vejledninger til regionen target valg. Guide RNA’er udføre den vigtige opgave at lokalisere dCas9 komponenterne til destinationsområderne DNA til at være dimerized og effektiviteten af vejledningerne er baseret på deres specifikke mål-webstedet. Uden ordentlig gRNA komponenter induceret CLOuD9 system ikke vil kunne danne reversibelt sløjfer. Således, ved at designe flere guider for hver region af interesse og sprede guider over et område af 250-1000 bp, mindst én vellykket vejledning vil blive sikret. Guide placering er også integreret til præcise resultater. Det er vigtigt at undgå guides, der findes i transskription faktor bindingssteder eller andre kritiske områder for at forhindre baggrundseffekter såsom op eller ned regulering af transkription. Derudover kan den præcise placering af CLOuD9 konstruktion lidt indflydelse transskription af target-genet. Dette understreger betydningen af prøvning flere par af guider for hver målområde, at identificere de mest robuste par til forsøgsformål. Yderligere, i hvert par af målområder, CSA-konstruktionen bør være målrettet med gRNAs for S. aureus, og CSP-konstruktionen bør være målrettet med gRNAs til S. pyogenes for målretning specificitet.
For at sikre nøjagtige resultater og korrekte dimerization, er det også vigtigt at bevare friskhed af de cellulære miljøer efter transduktion af CLOuD9 konstruktioner. Daglige media ændre og tilsætning af frisk dimerizer (eller kontrol) sikrer, at de supplerende konstruktioner vil forblive i nærhed og bevare den ændrede kromatin kropsbygning. Derudover er garanterer ABA er frisk og har været opbevaret korrekt efter producentens protokol (åbnet inden for 6 måneder, holdt koldt, beskyttet mod lys) afgørende for at opnå ægte resultater.
Navnlig, blev ABA dimerizer for CLOuD9 brugt med ABI og PYL dimerization proteiner, snarere end mere almindeligt udnyttet FRB og FKBP system. Nødvendigheden af en rapalog til FRB/FKBP-systemet ville have begrænset anvendelighed af CLOuD9, på grund af toksicitet for kræftceller. Alternative ABI/PYL systemet omgås denne begrænsning, effektivt gør det muligt for CLOuD9 at være mere bredt utilizable.
Kollektivt, har vi udviklet CLOuD9, en enestående og robust teknologi, der kan tvinge men reversibelt skabe kontakter mellem langtrækkende mål genomisk loci. Gennem overtalelse kromatin sløjfer, vise vi også, at CLOuD9 kan udnyttes til at ændre genekspression i den relevante cellulære kontekst. Tilpasningsevne af teknologien giver mulighed for ubegrænset undersøgelse af samspillet mellem enhver to genomisk loci, uden at der kræves forudgående kendskab til oprette sløjfer af områder eller looping mekanismer. CLOuD9’s unikke demonstreret reversibilitet kan desuden yderligere undersøgelse af de mekanismer, der springer i sygdommen og udvikling. Mens effekterne på mål af kromatin looping er blevet påvist klart, er der endnu at være data tilbyde indsigt i virkningerne af off-target looping og den efterfølgende indvirkning på på target sløjfer.
Vores data viser kun et par anvendelser af dette værktøj men indebærer den vigtige underliggende idé, kromatin arrangement er vejledende af genekspression. Vores teknologi kan bruges til at undersøge og afsløre nuancerne i kromatin struktur RIBOREGULATION, dermed forbedre den overordnede forståelse af rollen som kromatin foldning i transkription af gener. En bedre forståelse af nuancerne i transcriptional dynamics kan føre an i forskning og behandling af kræft, arvelige sygdomme og medfødte lidelser, i hvilke adskilt kromatin forsamling uden tvivl ændrer gen expression20, 21,22,23. Efterfølgende arbejde udnytte CLOuD9 teknologi vil belyse yderligere detaljer om arrangementet og dynamikken i kromatin domæner og hvordan de køre foldning for at opretholde stabil genekspression i både udvikling og sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo og hele Wang laboratoriet for teknisk support og kritisk læsning af manuskriptet. S.L.M. er blevet støttet i dette arbejde gennem NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) og National Cancer Institute (1F99CA222541-01). K.C.W. understøttes af en karriere Award for medicinsk forskere fra fondens Burroughs Wellcome, og er en Donald E. og Delia B. Baxter Foundation Fakultet Scholar.
RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | For K562 cell culture |
DMEM media | Life Technologies | 11995-065 | 1X, for 293T cell culture |
lentiCRISPR v2 | Addgene plasmid | #52961 | For CLOuD9 plasmid development |
pRSV-Rev | Addgene plasmid | #12253 | For lentivirus production |
pMD2.G | Addgene plasmid | #12259 | For lentivirus production |
pMDLg/pRRE | Addgene plasmid | #12251 | For lentivirus production |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | For lentivirus production |
anti-HA antibody | Cell Signaling | 3724 | For immunoprecipitation |
anti-Flag antibody | Sigma | F1804 | For immunoprecipitation |
DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For DNA extraction |
TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | For RNA extraction |
RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA extraction |
Superscript VILO | Life Technologies | 11754-050 | For cDNA |
SYBR Green I MasterMix | Roche | 4707516001 | For qPCR analysis |
Light Cycler 480II | Roche | For qPCR analysis | |
anti-H3K4me3 antibody | AbCam | ab8580 | For ChIP-qPCR |
anti-RNA Pol-II antibody | Active Motif | 61083 | For ChIP-qPCR |
EDTA free protease inhibitor | Roche | 11873580001 | For protein extraction |
4-12% Tris Glycine gel | Biorad | Any size, For western blot | |
anti-Rabbit HRP antibody | Santa Cruz | sc-2030 | For western blot |
anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling | 7076S | For western blot |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000AKU | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000APE | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000FCJ | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | GEO | GSM1479215 | For ChIP-seq analysis |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10001D | For immunoprecipitation |
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10004D | For immunoprecipitation |
RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | For RNA purification |
Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | For crosslinking |
PX458 Plasmid | Addgene | 48138 | Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For PCR purification |
FastDigest BsmBI | Thermo Fisher Scientific | FD0454 | For cloning guide RNAs |
FastAP | Thermo Fisher Scientific | EF0651 | For cloning guide RNAs |
10X FastDigest Buffer | Thermo Fisher Scientific | B64 | For cloning guide RNAs |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For cloning guide RNAs |
10X T4 Ligation Buffer | NEB | B0202S | For cloning guide RNAs |
T4 PNK | NEB | M0201S | For cloning guide RNAs |
2X Quick Ligase Buffer | NEB | B2200S | For cloning guide RNAs |
Quick Ligase | NEB | M2200S | For cloning guide RNAs |
Buffers | |||
Farnham lysis buffer | 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water | ||
Modified RIPA buffer | 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4 | ||
IP dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor | ||
Wash buffer | 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate | ||
Swelling buffer | 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40 | ||
Dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl | ||
IP elution buffer | 1% SDS, 10% NaHCO3 |