Immunophénotypage de homogreffe orthotopique (syngéniques) d’adénocarcinome Ductal pancréatique KPC primaires murines par cytométrie en flux
Summary
La procédure expérimentale sur l’immunophénotypage des homogreffes ACPE orthotopique murine vise à présenter le profil immuno-microenvironnement tumoral. Les tumeurs sont orthotopically implanté par la chirurgie. Tumeurs de 200 à 600 mm3 de taille ont été récoltés et dissociées pour préparer des suspensions unicellulaires, suivies d’analyse multi-immunitaire marqueur FACS à l’aide de différents anticorps fluorescent marqués.
Abstract
Homogreffe tumeurs (syngéniques) sont le produit phare de la recherche préclinique d’aujourd’hui immuno-oncologie (e/s). Le microenvironnement tumoral (TME), particulièrement ses composantes immunitaires, est essentiel pour le pronostic et la prévision des résultats du traitement, en particulier ceux de l’immunothérapie. TME immunitaire-composants sont composés de différents sous-ensembles de cellules immunitaires infiltrant de tumeur évaluables par FACS multicolore. Adénocarcinome canalaire pancréatique (CCPP) est parmi les plus meurtrières malignances manque d’options de traitement bon, donc un besoin médical urgent et non satisfait. Une des grandes raisons pour sa non-réponse aux divers traitements (chimio-et ciblé, I/O) a été sa TME abondante, composée de fibroblastes et de leucocytes qui protègent les cellules tumorales de ces thérapies. Orthotopically ACPE implanté est censé plus précisément reprendre la TME des cancers du pancréas humains que les modèles conventionnels de sous-cutanée (SC).
Homogreffe tumeurs (KPC) sont des greffes de souris spontanée ACPE originaires de KPC-souris génétiquement modifiées (KrasG12D / +/P53– / –/Pdx1-Cre) (CPK-GEMM). Le tissu de la tumeur primitive est coupé en petits fragments (~ 2 mm3) et transplanté par voie sous-cutanée (SC) aux destinataires syngéniques (C57BL/6, 7-9 semaines). Les homogreffes ont ensuite étaient chirurgicalement orthotopically transplanté sur le pancréas de nouvelles souris C57BL/6, ainsi que de la SC-implantation, qui atteint des volumes de 300 à 1 000 mm3 tumeur de 17 jours. Seulement des tumeurs de 400 – 600 mm3 ont été récoltés per opératoire agréé autopsie et nettoyés pour enlever les tissus non-tumeur adjacentes. Ils sont dissociés par protocole utilisant un dissociator tissus dans des suspensions unicellulaires, suivies par la souillure avec panneaux désigné d’anticorps fluorescent marqués pour les différents marqueurs de différentes cellules immunitaires (lymphoïdes, myéloïde et NK, DCs). Les échantillons colorés ont été analysées à l’aide multicolore FACS de déterminer le nombre de cellules immunitaires de lignées différentes, ainsi que leur pourcentage relatif dans les tumeurs. Les profils immunitaires des tumeurs orthotopique sont ensuite comparés à ceux des tumeurs SC. Les données préliminaires ont démontré significativement élevés TILs/TAMs infiltrantes dans les tumeurs sur le pancréas et supérieure infiltration de lymphocytes B orthotopique plutôt que les tumeurs SC.
Introduction
Adénocarcinome canalaire pancréatique (ACPE) provoque près de la moitié un million mortalités dans le monde entier chaque année, le top 5 du cancer meurtrière. Il y a peu d’options thérapeutiques efficaces et aucune immunothérapies approuvés ; par conséquent, les nouveaux traitements sont absolument nécessaires. Les cancers sont plus en plus reconnus comme des maladies immunologiques, incluant ACPE, outre les maladies génétiques, tel que connu aujourd’hui. Facteurs génétiques, immunologiques et déterminerait probablement pronostic de la maladie ainsi que le traitement résultats. Les tumeurs soustraire à la surveillance immunitaire hôte et finalement avancement pour causer la mort. Plusieurs de ces processus immunitaires produisent dans le microenvironnement tumoral (TME)1,2,3,4 où différents types de cellules immunitaires interagissent avec les cellules tumorales, entre eux et avec les autres tumeurs les composants stromales, directement ou indirectement par l’intermédiaire de cytokines qui déterminent en dernier ressort issue de la maladie. Caractérisation des composantes immunitaires tumeur de la TME, ou tumeur immunophénotypage, y compris le sous-typage, la numération et la localisation des différentes lignées de cellules immunitaires, est donc essentielle pour comprendre l’immunité anti-tumorale. Dans le cas de l’ACPE, il a été proposé qu’élevé tumeur-infiltration de macrophages suppressives (TAM) et les lymphocytes B ont conduit à la prévention de l’infiltration de lymphocytes et/ou l’activation et des niveaux élevés de fibrose5,6.
L’approche commune pour enquêter sur le système immunitaire eut expérimentalement utiliserait des modèles animaux précliniques de substitution tumeur, tumeur de souris principalement aux modèles7, particulièrement des souris syngénique (homogreffe) ou des modèles de souris génétiquement modifiées (GEMM) des cancers, sur la ressemblance présumée de la souris et l’homme pour les tumeurs et immunité8,9. En réalité, il est entendu qu’il y a des différences inhérentes entre les deux espèces10,11.
Les tumeurs de souris transplantées ont un avantage significatif sur des tumeurs spontanées7, à savoir le développement de tumeurs synchronisée, par contraste avec le développement de tumeurs spontanées GEMM parental. Homogreffes de tumeurs murines spontanées sont considérés comme des tumeurs primaires n’ayant jamais été manipulé in vitroet mise en miroir original souris tumeur histo- / moléculaire pathologie7, ainsi que des profils de système immunitaires possibles. Ces homogreffes murins sont souvent considérés comme « une version de souris des xénogreffes dérivés de patient (PDXs) ». Par conséquent, ils ont probablement une meilleure traduisibilité de cellule syngénique classiques dérivé souris tumeurs12. En particulier, nombreux homogreffes sont dérivés de GEMM spécifique où des mécanismes spécifiques de la maladie humaine, par exemple les mutations oncogéniques pilote, ont été conçus, et ces homogreffes devraient donc avoir des avantages à leur pertinence clinique. En particulier, la KPC GEMM développer souris ACPE dans 15 à 20 semaines d’âge, qui récapitule morphologiquement des maladies humaines avec architecture glandulaire de surtout bien à modérément-dissociés et hautement enrichi stroma. Ce modèle reprend également les fonctions génétiques les plus courantes du CCPP humaine, à savoir Kras en activant la mutation et la perte de fonction P53, qui se produisent à 90 % et 75 % des humain ACPE, respectivement de5,6.
Sites de transplantation ont également été suggérés à jouer un rôle dans la traduisibilité modèle. L’environnement tissulaire spécifique, comme dans un environnement orthotopique correspondante, pourrait être une niche pour les tumeurs spécifiques aux environnements de progrès, par opposition à l’uniform sous-cutanée (SC) pour les tumeurs couramment greffés. Il serait particulièrement intéressant if, et/ou, quelle différence existe entre les deux sites de transplantation, sur le plan immunitaire-microenvironnement et la pertinence de cancer chez l’humain, par exemple. dans le cas de l’ACPE.
Un des aspects plus importants de profilage immunitaire ou immunophénotypage, est de déterminer les cellules immunitaires infiltrant de tumeur différentes lignées, les nombres, pourcentage relatif dans les tumeurs, ainsi que leurs États d’activation et les emplacements. Cela inclut la tumeur-infiltratrating lymphoctyes (TILs, tant T – B-), tumeur-infiltration de macrophages (EAPV), tumeur-infiltration des cellules tueuses naturelles (NKs) et tumeur non-résidents dendritiques cellules3,13,14 , 15 , 16 , 17et la localisation subcellulaire de certaines cellules18,19,20, etc.. Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) ou écoulement cytometry est une technologie de détection de la cellule unique qui est couramment utilisée pour mesurer les paramètres spécifiques d’une cellule. Multi-color flow cytometry mesures des marqueurs multiples sur une seule cellule3,4,21 et est la méthode la plus couramment utilisée pour déterminer le nombre et le pourcentage relatif des différents sous-ensembles de cellules immunitaires, notamment dans les tumeurs.
Ce rapport décrit les procédures pour le profilage des cellules immunitaires infiltrant de tumeur : 1) l’Implantation des homogreffes tumeur orthotopique ACPE souris, ainsi que l’implantation de SC ; 2) tumeur tissulaire récolte et préparation de cellule unique par l’intermédiaire de dissociation de la tumeur ; 3) analyse en cytométrie en flux de toutes les cellules dérivées de tumeurs comme point de départ ; 4) Comparaison des profils de la base de ces deux approches de la transplantation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que les études utilisant des tumeurs SC sont réalisées plus facilement, orthotopically implanté tumeurs modèles peuvent potentiellement être plus pertinentes pour les études de pharmacologie préclinique (en particulier les enquêtes I/O) pour fournir la traduisibilité améliorée. Ce rapport vise à aider le lecteurs/audience intéressée pour être en mesure de visualiser directement les procédures techniques qui peuvent être utilisés dans leurs recherches respectives. Nos protocoles de démontrent cett…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs seraient remercie Dr Jody Barbeau – lecture critique et l’édition du manuscrit et remercier Ralph Manuel pour la conception des œuvres d’art. Les auteurs tiens également à remercier l’équipe de couronne Bioscience oncologie Immuno-oncologie biomarqueur et oncologie In Vivo , pour leurs grands efforts techniques.
Materials
| Anesthesia machine | SAS3119 | ||
| Trocar 20 | 2mm | ||
| Petri dish | 20mm | ||
| 100x antibiotic and antimycotic | |||
| Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Liquid nitrogen | Air chemical | ||
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
| antibodies | BD | ||
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
| Studylog software | Studylog | software | |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
| RNAlater | Thermo | am7021 |
References
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